microRNA-451是长约22nt的内源性非编码小分子RNA,通过作用于靶mRNA使其降解或抑制其转录后翻译,从而调控基因表达、细胞周期以及细胞的增殖与坏死。蛋白激酶B(P-AKT)是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,活化的AKT通过磷酸化下游的许多靶蛋白,发挥其生物学活性,可以调节基因的转录、翻译以及翻译后加工,从而调节细胞周期,抑制细胞凋亡。肺移植已成为各种终末期肺部疾病的重要治疗手段,而缺血再灌注损伤是影响肺移植成功率的最大制约因素。近年来,随着micro-RNA及其下游调节机制影响肿瘤细胞增殖的研究不断深入,其在缺血再灌注损伤中的作用也越来越受到关注,但在肺缺血再灌注过程中,microRNA及其下游调节蛋白的表达变化尚少有报道。基因芯片技术研究结果显示,缺血肺组织中microRNA-451的表达量上调2倍以上。本实验应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)及Western blot方法,检测缺血再灌肺组织中microRNA-451及p-AKT蛋白的表达情况。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
健康清洁级雄性Wistar大鼠50只,体质量为250~300g,均购自山东鲁抗医药公司实验动物中心;PrimeScriptRT reagent Kit及Premix ExTaqTM,均购自大连宝生物工程有限公司;TaqManMicroRNA Assay Kit,购自Applied Biosystems公司;兔抗大鼠GAPDH单克隆抗体和山羊抗兔单克隆抗体,均购自康维世纪公司;兔抗大鼠p-AKT多克隆抗体,购自Santa Cruz公司。
1.2 实验方法
Wistar大鼠50只,随机分为对照组、缺血组、再灌注1h组、再灌注3h组、再灌注6h组,每组10只大鼠。麻醉大鼠,行气管插管后接呼吸机,仰卧位固定大鼠,于胸骨左侧第5肋间进胸,松解下肺韧带,游离出肺门根部,手术中注意保护肺组织,避免组织损伤。予100U肝素静注,5min后(肺中度膨胀时),于肺门处用血管夹阻断血流,手术后碘附水冲洗胸腔,无菌敷料覆盖切口。对照组于松解下肺韧带后取材,不作血流阻断;缺血组于阻断肺门1h后取材;再灌注1、3、6h组于阻断肺门1h后去除血管夹,恢复肺组织血供,分别于再灌注1、3、6h后取材,取材前予生理盐水冲洗肺组织。阻断上、下腔静脉血流处死动物。穿刺左心耳,经右心室行压力灌洗(30mL生理盐水,2.94kPa),完整取出左全肺后,置液氮中-80℃保存。
1.3 检测指标及方法
1.3.1总RNA、总蛋白提取及测定用TRIzol及microRNA提取专用试剂盒,提取标本肺组织的总RNA,紫外线分光光度计测定吸光度(A)值。蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂中研磨并超声裂解肺组织,离心,加SDS后水浴,-20℃保存。
1.3.2 microRNA-451蛋白表达检测采用RT-qPCR方法,通过microRNABase及相关文献获取其引物序列。microRNA-451引物序列:5′-AAA-CCGUUACCAUUACUGAGUU-3′,应 用Prime-ScriptRT reagent Kit试剂盒TaqMan探针分析法进行逆转录,逆转录产物cDNA置-20℃冰箱保存备 用。按 照Premix Ex Taq及TaqManMi-croRNA Assay Kit试剂说明书进行PCR标准程序扩增,U6为内参(引物序列为5′-GTGCTCGCTTC-GGCAGCACATATACTAAAATTGGAACGATA-CAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAG-GATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCAT-ATTT-3′),检测microRNA-451相对表达量。
1.3.3 P-AKT蛋白表达检测采用Western blot方法,以GAPDH作为对照,行SDS-PAGE电泳。
电泳完成后转至硝酸纤维膜上,室温下封闭2h,TBST缓冲液洗3次,加入兔抗大鼠p-AKT多克隆抗体(1∶1 500),4℃孵育过夜;用TBST漂洗3次,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶4 000),室温孵育1h;TBST及TBS各洗3次,ECL系统曝光显影,凝胶分析系统分析p-AKT蛋白的表达。实验重复3次。
1.4 统计学处理应用SPSS 19.0软件进行统计学处理,数据间比较采用单因素方差分析及LSD-t检验法,以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 各组microRNA-451表达比较对照组、缺血组、再灌注1h组、再灌注3h组、再灌注6h组microRNA-451相对表达量分别为0.39±0.34、1.79±1.27、1.86±0.98、2.08±1.44、0.58±0.63。与对照组比较,缺血组、再灌注1h组、再灌注3h组、再灌注6h组microRNA-451的相对表达量呈现先上调后下调的趋势,其中再灌注3h组microRNA-451的表达量最高,差异有显著意义(F=17 244.32,P<0.05)。
2.2 各组p-AKT蛋白表达比较对照组、缺血组、再灌注1h组、再灌注3h组、再灌注6h组的p-AKT蛋白相对表达量分别为0.32±0.01、0.18±0.02、0.16±0.01、0.13±0.01、0.21±0.02。对照组AKT蛋白相对表达量最高,再灌注3h组表达量最低,差异有显著性(F=136.02,P<0.05)。
3 讨论
microRNA是一类内源性非编码小RNA,具有高度保守的基因序列,在RNA聚合酶Ⅱ的催化下细胞核内转录出序列较长的pri-microRNA,经过Drosha酶及Dicer酶的修饰可形成成熟的micro-RNA,它可与序列基本互补的mRNA结合,通过阻止蛋白质翻译过程或直接降解mRNA,实现基因表达的调控作用,从而影响细胞的增殖、分化、凋亡、新陈代谢等过程。NAN等研究结果显示,micro-RNA-451可抑制胶质瘤细胞生长、增殖,促进细胞的凋亡。WANG等研究结果显示,microR-451可靶向调控RAB14,从而显著抑制非小细胞肺癌生长。
BRANDRES等研究显示,microRNA-451在胃及结直肠癌中呈低表达,且表达水平与预后呈正相关,将pre-microRNA-451转染入结直肠癌细胞中,肿瘤细胞生长受到抑制。TIAN等研究显示,人脑胶质瘤细胞中microRNA-451可通过CAB39抑制PI3K/AKT途径,从而抑制肿瘤细胞生长。
AKT蛋白是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,它处于PI3K/Akt信号转导通路的核心部位,可通过PDK-1磷酸化Thr308、Ser473两个位点后,实现完全激活,发挥生物学活性。近年来,对于p-AKT的研究不断深入,大量研究证实,AKT蛋白具有促进细胞生长增殖,抑制细胞凋亡的作用。已有研究结果显示,p-AKT蛋白在非小细胞肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳癌、卵巢癌、胃癌及结直肠癌等组织中均表达增高。WIDMANN等研究结果显示,细胞凋 亡 时,AKT可 出 现 水 解 现 象,表 达 量 降 低。JETZT等将AKT的磷酸化位点灭活,通过一种复制缺陷型腺病毒将失活的AKT转入肿瘤细胞,发现肿瘤细胞的增殖受到抑制。
本研究应用RT-qPCR以及Western blot法,检测microRNA-451及P-AKT蛋白在大鼠肺缺血再灌注组织中的表达情况,结果显示两者在表达上存在一定的相关性。结合相关文献结果,认为microRNA-451可能通过调节p-AKT蛋白的表达对细胞的增殖和凋亡发挥作用。本文的实验结果显示,随着缺血再灌注时间的延长,microRNA-451的表达呈现先上调后下降的趋势,而p-AKT蛋白的表达则是呈现先下降后上调的相反的结果,推断microRNA-451促进细胞凋亡的作用可能是通过调节p-AKT蛋白通路实现的。这有可能为肺缺血再灌注损伤的预防及治疗提供一条新的思路。但是,microRNA-451对p-AKT蛋白调节的具体机制尚需要进一步研究。microRNA-451是否存在其他靶点对缺血再灌注损伤进行调控及p-AKT蛋白调控细胞周期的具体机制目前尚未得到证实。