探讨了低氧对不同级别PASMCs增生及迁移的影响

　　肺血管急性缺氧性收缩反应和慢性缺氧性肺血管结构重建是缺氧性肺动脉高压发生的主要机制，肺血管重构最重要的病理变化是肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)从中膜大量迁移至内膜合并凋亡和增生的失衡。研究表明，缺氧性肺动脉高压血管结构重建在远端肺动脉表现的比近端肺动脉更加显着，而且在低氧条件下离体肺血管收缩实验中，小动脉的收缩及敏感性远远高于大动脉。可见小动脉的病理变化在疾病过程中起到了至关重要的作用。但是在同样的病理刺激下，小动脉更容易发生重构的机制尚不明确。因此，探索并且验证肺小动脉与大动脉功能的差异，初步分析小动脉更易发生重构可能的病理、生理机制，对于预防早期肺血管的重构以及延缓肺动脉高压的发生、发展至关重要。本研究利用原代培养的大鼠不同级别 PASMCs，探讨了低氧对不同级别 PASMCs 增生及迁移的影响。　　1 材料与方法　　1． 1 主要试剂及仪器平滑肌细胞基础培养基 (dulbecco’s modifiedeagle’s medium，DMEM)购于美国 Sciencell 公司;胎牛血清(fetal calf serum，FBS)购于美国 Gibcobrl 公司;青霉素、链霉素均购于美国 Invitrogen 公司;胰蛋白酶、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)等试剂购于美国Sigma 公司; EDTA、四甲基偶氮唑盐 ( methyl thiazolyltetrazolium，MTT)购于美国 Amresco 公司;PCNA 购于美国 Santa Cruz Biotecnology;平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin，α-SMA)购于英国 Abcam 公司;β-actin 购于美国 Sigma 公司。其余试剂均为国产分析纯。　　1． 2 实验方法　　1) 大鼠 PASMCs 的原代培养:取体质量约为250 ～ 300 g 健康雄性 SD 大鼠 4 只，由首都医科大学动物实验中心提供，实验动物许可证号:SYXK(京)2010-0020。腹腔注射 2% 戊巴比妥钠(50 mg / kg) 麻醉后，无菌操作下迅速分离出心肺组织，置于盛有含有 1%青链霉素的 PBS 培养皿中，体式显微镜下分离各肺叶的肺动脉。按照肺动脉的分级将肺血管分为 3组:大动脉组(n =4)，包括肺动脉干及肺内一级主干;中动脉组(n =4)，包括肺内主干的二级及三级分支;小动脉组(n =4)，包括肺内动脉四级以上分支。用眼科镊小心剥除外膜，纵向剪开肺动脉，用刮匙来回轻刮 2 ～ 3 遍，去除内膜，仅留中膜平滑肌组织层，用眼科剪反复剪成 1 mm ×1 mm 的小组织块，随后放入预先盛有3 mL Ⅱ型胶原酶消化液(1 800 U/mL)的离心管中 37 ℃水浴静置 20 min，待组织边缘呈现絮状后，1 000 r / min 离心 5 min，弃上清液，向组织沉淀中加入含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基，轻轻吹打，制成细胞悬液接种于 35 mm 培养皿中，于 5% CO2培养箱 37℃ 培养。　　2) 实验分组:每次实验前取状态良好的 4 ～ 7 代对数生长期细胞，当细胞贴壁生长至 80% ～90% 融合时进行细胞计数后分组接种。待细胞贴壁后换为无血清 DMEM 培养基培养24h 使细胞同步化，再采用数字表法随机分为:常氧对照组(DMEM + 2% FBS、5%CO2、21%O2、37 ℃培养 48 h);低氧处理组(DMEM +2% FBS、5% CO2、3%O2、37 ℃培养 48 h)。　　3) 大 鼠 PASMCs 的 免 疫 荧 光 鉴 定: 将 大 鼠PASMCs 接种于 24 孔板内的盖玻片上，单层铺满后，搜集细胞爬片，4%的多聚甲醛室温固定 30 min，加入10% 羊血清封闭 30 min。0． 2% Triton X-100 溶液室温孵育 30 min。加入一抗(anti-α-SMA，1∶ 100)4 ℃孵育过夜，Alexa Fluor 488 标记的二抗 IgG (1∶ 100)室温避光孵育 1 h。用含 DAPI 的封片剂封片后激光共聚焦荧光显微镜下观察结果。　　4)MTT 法检测:以每孔 5 × 103个细胞接种于 96孔板，每组设 6 个复孔，设不加细胞只加培养液的孔为空白孔。待细胞贴壁后加入无血清 DMEM 培养基培养 24 h 使细胞同步化，分 2 组，分别在常氧和低氧条件下培养 48 h。干预结束后，每孔加入 200μL 新配制的 MTT(0． 5 g/L)，置于 37 ℃、5% CO2培养箱内继续孵育 4 h。弃去上清液后每孔加入 150 μL 二甲亚砜(DMSO)，将 96 孔板置于全波长酶标仪中低速振荡 10 min，选择 490 nm 波长，在酶标仪上测定各孔的吸光度值。实验重复 3 次。　　5)Western blotting 检测: 取分组处理后的大鼠PASMCs，弃培养基，PBS 清洗 2 遍，加入预冷的 ＲIPA蛋白裂解液(含1%蛋白酶抑制剂)30 μL 裂解细胞，15min 后收集至 1． 5 mL EP 管中，超声作用 3 次，冰上静置 30 min 后 4 ℃、12 000 r/min 离心 5 min，吸取上清BCA 法测蛋白浓度。蛋白样品，进行 12% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-poly-acrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE) 电泳，NC 转膜，脱脂奶粉非特异性封闭后，加入 PCNA(1∶ 200)和β-actin(1∶ 2 000)，4 ℃过夜，IＲDye 800CW 连接的二抗(1∶ 10 000)避光孵育 1 h，用 Odyssey 红外荧光成像系统检测蛋白相对含量。以 Image J 软件对蛋白表达条带进行灰度扫描及定量分析。　　6) 伤口愈合实验:将大鼠 PASMCs 接种于 6 孔板中，生长至 100% 汇合后用 1 mL 枪头在孔板底部作2 ～ 3 条平行的划痕，分 2 组处理 48 h 后，低倍镜下观察细胞伤口愈合情况。　　1． 3 统计学方法 应用 Graph Pad Prism 5． 0 分析作图软件和 SPSS13． 0 统计学软件进行数据处理，数据采用平均值 ± 标准误(x珋 ± SE)表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD 统计学方法。以 P ＜0． 05为差异有统计学意义。　　2 结果　　2． 1 细胞形态学鉴定与免疫荧光鉴定 经倒置相差显微镜观察，3 组肺动脉组织经原代培养 2 ～3 d 后，逐渐有细胞从组织块中爬出，细胞贴壁生长，呈长梭形放射状，7 ～ 10 d 后细胞逐渐融合，呈现出典型的平滑肌细胞“峰 － 谷”状生长特点(图1) ，且 3 组细胞在形态上未表现出明显差异。α-SMA的细胞免疫荧光显示，3 组细胞的细胞质中均有较多与细胞纵轴相平行的丝状绿色荧光，即为平滑肌细胞特有的肌动蛋白，表明本实验条件下培养的细胞主要为 PASMCs(图 2)。　　 2． 2 低氧对 3 组大鼠 PASMCs 增生功能的不同影响 分别对 3 组 PASMCs 进行常氧(DMEM + 2%FBS、5% CO2、21% O2、37 ℃) 和低氧(DMEM + 2%FBS、5% CO2、3%O2、37 ℃)干预48 h 后，采用 MTT 法检测细胞活力。常氧条件下，3 组 PASMCs 细胞吸光度值分别为(1． 370 ± 0． 700，1． 661 ± 0． 136，1． 568 ±0． 144，n = 3，P ＞ 0． 05)，差异无统计学意义。而在低氧处理后，小肺动脉和中动脉组 PASMCs 细胞吸光度值分别为2．504 ±0． 093 和 2． 729 ±0． 038，显着高于大肺动脉组PASMCs 的吸光度值1．953 ±0．116，差异均有统计学意义(n =3，P ＜0． 01，图 3A)，说明低氧情况下，中小动脉肺血管平滑肌细胞具有更强的增生能力。　　PCNA 是增生细胞核抗原，与细胞 DNA 合成关系密切，在细胞增生的启动中起重要作用，其表达含量代表细胞的增生能力。Western blotting 的结果也显示出，在常氧条件下，3 组 PASMCs 内 PCNA 表达含量灰度值分别为(0． 415 ± 0． 052，0． 551 ± 0． 089，0． 381 ±0． 108，n = 4，P ＞ 0． 05)，无明显表达差异。低氧干预后，中小肺动脉组 PASMCs 的 PCNA 表达含量明显升高，分别为 0． 853 ±0． 023 和 0． 885 ±0． 089，显着高于大肺动脉组 PASMCs 的 PCNA 表达含量(0． 509 ±0． 028)，差异均有统计学意义(n = 4，P ＜ 0． 01，图3B)，进一步说明中小肺动脉平滑肌细胞增生能力高于大肺动脉平滑肌细胞。　　2． 3 低氧对 3 组大鼠 PASMCs 迁移功能的不同影响　　选取生长状态良好的同一代 PASMCs 进行实验，待细胞贴壁后用无血清 DMEM 培养基饥饿 24 h 使细胞同步化，随后用枪头在培养皿底部作 2 ～3 条平行的划痕，按照分组情况给予常氧和低氧干预 48 h 后，分别对迁移到空白区域的细胞个数进行计数。常氧条件下，3 组 PASMCs 的细胞迁移数量分别为(49． 000 ±7． 810，68． 000 ± 7． 767，71． 000 ± 4． 041，n = 3，P ＞ 0． 05)，差异均无统计学意义。而在低氧干预后，中小肺动脉组的 PASMCs 迁移到空白区域的细胞个数分别为102． 300 ± 4． 842 和 141． 000 ± 9． 644，均显着高于大肺动脉组 PASMCs 的细胞迁移数量 62． 670 ±5．044，差异均有统计学意义(n =3，P ＜0．01，图4)。　　　　3 讨论　　肺动脉高压是由多种发病机制引起的以肺动脉收缩增强、中小肺动脉重构为主要病理、生理变化，最终导致肺血管阻力持续性增加、肺动脉压力升高的复杂性疾病。肺动脉的重构主要表现为 PASMCs 的增生与肥大，管壁变厚，内径变窄等。　　在临床肺动脉高压的患者以及肺动脉高压的动物模型中，均发现肺血管重构主要发生在末端的小动脉，并且呈逐渐进展性，最终导致末端血管的闭塞，提示肺动脉高压发生的主要部位在远端肺动脉，有研究显示，大鼠肺内一级动脉主干直径为 600 ～800 μm，二级动脉分支直径为 400 ～ 600 μm，三级动脉分支直径为 100 ～ 400μm，而四级动脉分支及以上，动脉直径只有不到100μm。　　在低氧28 d 后，直径小于200 μm 的微小肺动脉已经闭塞消失，在低氧性肺血管收缩实验中，小动脉的收缩及敏感性高于大动脉，血管直径的动脉变化显示，小于500 μm 的中小肺动脉有一个明显的减少过程，而其中最显着的变化则发生在直径为 200 ～ 300 μm 的肺动脉中。但是对于不同级别肺血管反应性不同的细胞与分子机制目前尚不清楚。　　本研究采用胶原酶消化法原代培养正常大鼠 3 组PASMCs，获得的 PASMCs 呈长梭形，培养2 ～3 d 后呈簇状或并行排列生长，7 ～10 d 后细胞融合呈“峰-谷”状生长，表现出典型的血管平滑肌细胞形态学特征。平滑肌α-SMA 蛋白是血管平滑肌表达的特征蛋白。本实验通过激光共聚焦荧光显微镜免疫荧光染色发现，大鼠 3组 PASMCs 免疫荧光染色呈阳性反应，可见典型的、并行排列的绿色纤维，证实 PASMCs 表达平滑肌 α-SMA 蛋白，符合血管平滑肌细胞的免疫学结构特征。　　PASMCs 由收缩型向合成型转换即增生能力增强并从肺动脉中膜迁移至内膜(迁移功能增强)是低氧导致肺血管重构的关键环节。本实验将原代培养 PASMCs 分别暴露于常氧与低氧环境中，用 MTT 和Western blotting 的方法检测细胞增生情况，用伤口愈合实验检测细胞的迁移能力，发现在低氧条件下中小肺动脉组 PASMCs 的增生与迁移能力均显着高于大肺动脉组 PASMCs，因此 3 组肺动脉的确在生理条件下已存在某些潜在的差异，使得在低氧时中小肺动脉更加敏感，促使其更易发生血管重构。　　以往有研究认为可能与分布在肺的大动脉和小动脉的平滑肌属性的不同和中层平滑肌细胞在肺近端与远端动脉的细胞组成上的不同有关。肺小动脉平滑肌细胞的细胞表型，细胞内骨架蛋白的表达和离子通道的开放情况与大动脉相比同样存在着显着的差异，这有可能是其具有特殊功能的原因之一。缺氧可以通过抑制 K+通道来促进膜的去极化，从而激活 L-型 Ca2 +通道最终使得小肺动脉发生收缩。在低氧条件下，平滑肌细胞内 K+通道的表达与功能不同，影响蛋白表达的转录因子也不同。　　本研究尚存在许多不足。首先只是根据血管的分支将肺动脉分成了 3 组，并没有严格的根据血管直径进行划分;其次，本研究只是在细胞水平上进行的相关功能的研究，并没有在组织水平上研究低氧对于3 组血管重构的影响;第三，关于低氧对 3 组 PASMCs其他相关细胞功能，例如对细胞凋亡的功能影响有待进一步深入研究。　　综上所述，本研究在细胞水平上证实了肺大中小肺动脉 PASMCs 确实存在着功能上的差异，在低氧条件下，中小肺动脉组 PASMCs 增生及迁移能力更强。本实验结果为进一步研究肺小动脉易发生重构的机制提供了一定的理论依据。　　4 参考文献　　［1］ Sklepkiewicz P，Sehermuly Ｒ T，Tian X，et al． Glycogensynthasekinase 3 beta contributes to proliferation of arterialsmooth muscle cells in pulmonary hypertension［J］． PLoSOne，2011，6(4) :e18883． ［2］ Archer S L，Wu X C，Thebaud B，et al． Preferential ex-pression and function of voltage-gated， O2-sensitive K+channels in resistance pulmonary arteries 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