原标题:高氧液联合缺血后处理对家兔肠缺血再灌注致肝损伤的保护作用
摘要:目的探讨高氧液联合缺血后处理对家兔肠缺血再灌注所致肝损伤的保护作用.方法将家兔48只随机分为假手术组(SO组)、缺血再灌注组(IR组)、高氧液组(HO组)和高氧液缺血后处理组(HI组),每组12只.SO组家兔仅手术显露肠系膜上动脉(SMA);IR组家兔阻断SMA60min,再灌注120min;HO组家兔在阻断SMA60min和再灌注120min过程中静脉输入高氧液;HI组家兔于阻断SMA60min后,再灌注开始时静脉输入高氧液,同时进行3个循环的30s再灌注/30s阻断的缺血后处理.再灌注120min后采集各组家兔动脉血、静脉血及部分小肠、肝组织,检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-10、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)及内毒素水平,测定血清及小肠、肝组织内丙二醛(MDA)含量及髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)活性,Chiu6级评分法观察肠黏膜损伤情况,细菌培养观察细菌移位率,免疫组织化学观察肝组织中核因子κB(NF-κB)p65的表达.结果IR组家兔血清中TNF-α、IL-10、内毒素水平显着高于SO组(P<0.01);HO组和HI组家兔血清中TNF-α、内毒素水平显着低于IR组(P<0.05);HI组家兔血清中TNF-α、内毒素水平显着低于HO组(P<0.05,P<0.01).HO组和HI组家兔血清中IL-10水平显着高于IR组(P<0.01),HO组和HI组家兔血清中IL-10水平比较差异无统计学意义(P>0.05).IR组家兔血清中MPO活性和MDA水平显着高于SO组(P<0.01),HO组和HI组家兔血清中MPO活性和MDA水平显着低于IR组(P<0.01);HI组家兔血清中MPO活性和MDA水平显着低于HO组(P<0.05,P<0.01).IR组家兔血清中SOD活性显着低于SO组(P<0.01),HO组和HI组家兔血清中SOD活性显着高于IR组(P<0.01),且HI组家兔血清中SOD活性显着高于HO组(P<0.01).IR组、HO组和HI组家兔肠黏膜损伤评分显着高于SO组(P<0.01),HO组和HI组家兔肠黏膜损伤评分显着低于IR组(P<0.01),HI组家兔肠黏膜损伤评分显着低于HO组(P<0.05).IR组家兔小肠黏膜组织中MPO活性和MDA水平显着高于SO组(P<0.01);HO组和HI组家兔小肠黏膜组织中MPO活性和MDA水平显着低于IR组(P<0.01);HI组家兔小肠黏膜组织中MPO活性和MDA水平显着低于HO组(P<0.05).IR组家兔小肠黏膜组织中SOD活性显着低于SO组(P<0.01);HO组、HI组血清SOD活性仍显着高于IR组(P<0.01);HI组家兔小肠黏膜组织中SOD活性显着高于HO组(P<0.05).SO组家兔肝组织均无细菌移位,IR组家兔肝脏细菌移位率100.0%,HO和HI组家兔肝脏细菌移位率均为83.3%,HO和HI组家兔肝脏细菌移位率与IR组比较差异均无统计学意义(P>0.05).IR组、HO组、HI组家兔肝组织内NF-κBp65阳性表达显着高于SO组(P<0.01),HO组和HI组家兔肝组织内NF-κBp65阳性表达显着低于IR组(P<0.01),HI组家兔肝组织内NF-κBp65阳性表达显着低于HO组(P<0.05).IR组家兔肝组织中MPO活性及MDA、ALT、AST水平显着高于SO组(P<0.01);HO组和HI组家兔肝组织中MPO活性及MDA、ALT、AST水平仍显着低于IR组(P<0.01);HI组家兔肝组织中MPO活性及MDA、ALT、AST水平显着低于HO组(P<0.05).IR组家兔肝组织中SOD活性显着低于SO组(P<0.01),HO组和HI组家兔肝组织中SOD活性显着高于IR组(P<0.01);HI组家兔肝组织中SOD活性显着高于HO组(P<0.05).结论高氧液联合缺血后处理可以减轻肠缺血再灌注引起的肝损伤.
关键词:高氧液;缺血后处理;肠缺血再灌注损伤;肝损伤
肠缺血再灌注损伤( ischemical reperfusion inju-ry,IRI) 在严重感染、创伤、休克、心肺功能不全及小肠移植的病理演变过程中起重要作用[1],不仅可以引起肠黏膜上皮细胞吸收功能下降、肠黏膜屏障功能受损及肠道内正常菌群失调,引发全身炎症反应综合征,还可以造成肝损伤,具有较高的发病率和病死率[2],在这一过程中引起器官早期损害的直接首要因素是组织缺氧.高氧液是一种具有高氧分压并含有治疗剂量臭氧的医用液体,可以通过物理方法改变氧的活性,使氧离子化,并在一定的压力下溶解于水,再通过分子载体将氧直接带入血液循环,增加组织氧储备,提高机体的缺氧耐受能力,可以部分代偿向组织细胞供氧,已应用于肝移植及缺血缺氧性脑病的研究[3].缺血后处理( ischemic post-condi-tioning,IP) 是指在长时间缺血的组织或器官再灌注起始即刻采取反复短暂的再灌注/停灌注,之后再恢复正常灌注,达到减轻组织或器官 IRI 的目的[4].有研究发现,不同的保护措施联合应用对缺血器官的再灌注损伤可取得更好的治疗效果[5-6].目前针对二者联合应用对小肠 IRI 保护作用鲜有报道,本研究拟通过高氧液联合 IP 干预家兔肠 IRI 模型,探讨其对小肠及肝损伤的保护作用.
1 材料与方法
1. 1 实验动物 健康家兔 48 只由新乡医学院实验动物中心提供,雌雄不拘,体质量 2. 5 ~3. 7 kg,于新乡医学院实验动物中心喂养,空气湿度50. 0% ~55. 0% ,室温 ( 18. 0 ± 4. 0 ) ℃ ,光照随昼夜自然变化,标准饮食,自由饮水,术前禁食 12 h.实验计划通过新乡医学院第一附属医院伦理委员会批准,实验过程符合《关于善待实验动物的指导性意见》的规定.
1. 2 主要试剂及仪器 内毒素放射免疫试剂盒购自美国 Sigma 公司,肿瘤坏死因子-α( tumor necrosisfactor,TNF-α) 、白细胞介素-10( interleukin-10,IL-10)检测试剂盒购自晶美生物工程有限公司,丙二醛( ma-londialdehyde,MDA) 、髓 过 氧 化 物 酶 ( myeloperoxi-dase,MPO) 和超氧化物歧化酶( superoxide dismutase,SOD) 检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所,链霉亲和素-生物素复合物( strept avidin-biotin complex,SABC) 免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司,兔抗大鼠核因子 κB( nuclear factorkappa B,NF-κB) p65 I 抗购自 Santa Cruz; GY-1 型高氧医疗液体治疗仪购自西安高氧医疗设备有限公司.
1. 3 高氧液的制备 用医用生理盐水 500 mL 作为基液,将医用氧通过 GY-1 型高氧医疗液体治疗仪进行量子化处理,通过增加基液的净水压,去除基液中的气核,提高其表面张力,使生理盐水变成高氧液,应用血气分析法测得溶氧前液体氧分压为( 20. 2 ±0. 4) kPa,溶氧后氧分压达到( 106. 2 ± 7. 8) kPa,整个配制过程根据机器的菜单提示完成操作.
1. 4 家兔肠缺血再灌注模型建立 称家兔体质量,耳缘静脉注射30 g·L- 1戊巴比妥钠30 mg·kg- 1麻醉,仰卧固定( 背部交叉) .颈部正中切口,分离右颈总动脉,插管连接压力传感器,通过监护仪监测动脉压.常规消毒后取腹部正中切口: 腹正中线自剑突下 2 cm 起向下作 6 cm 长切口,将腹腔内脏器左移,并齐右肾门垂直分离腹主动脉分出的肠系膜上动脉( superior mesenteric artery,SMA) ,在 SMA 根部用 1 个套硅胶管的小动脉夹钳夹,观察 2 min,待确定 SMA 血流己被阻断,肠壁苍白,血管无搏动后,缝合伤口,关闭腹腔.60 min 后重新开腹,打开动脉夹,恢复 SMA 血流供应,肠壁变红,血管搏动良好,再次关闭腹腔; 为避免体液及热量的丧失,再灌注2 h 后,重新开腹取标本.移动腹腔内脏器时动作要轻柔,不可过度牵拉损伤肠管,脏器不移出腹腔外,避免使用锐利器械分离 SMA,以免造成大出血而导致实验失败.
1. 5 实验分组 48 只大鼠随机分为 4 组,每组 12只.假手术组( SO 组) : 仅行开腹术,分离 SMA 不夹闭; 缺血再灌注组( IR 组) : 阻断 SMA 60 min 造成小肠缺血,然后打开动脉夹恢复血流灌注,于再灌注120 min 结束实验; 高氧液组( HO 组) : 在阻断 SMA60 min 和再灌注120 min 过程中以20 mL·kg-1·min-1速度静脉输入高氧液,其余操作同 IR 组; 高氧液 IP组( HI 组) : 于夹闭 SMA 60 min 后,于再灌注开始时以 20 mL·kg- 1·min- 1速度静脉输入高氧液,同时进行 3 个循环的 30 s 再灌注/30 s 阻断的 IP,总时间为 3 min,然后持续灌注 117 min 后结束实验.
1. 6 标本采集 家兔在再灌注 2 h 后,在无菌操作下重新开腹,处死前抽取腹主动脉血和外周静脉血各 5 mL; 另取 1 mL 门静脉血,采用合成基质偶氮显色法定量分析血液中细菌内毒素含量; 静脉血低温离心,分离血清,全自动生物化学分析仪检测血清中丙氨酸氨基转移酶( alanine aminotransferase,ALT) 、天冬氨酸氨基转移酶 ( aspartate aminotransferase,AST) 水平; 动脉血清中 TNF-α、IL-10 水平测定采用双抗体夹心酶联免疫吸附法,严格按照试剂盒说明书操作.无菌操作下切取部分小肠组织及肝组织,一部分于体积分数 4% 甲醛溶液中固定 48 h,经脱水透明、浸蜡、包埋后,切成4 μm 石蜡切片,苏木精-伊红( hematine eosin,HE) 染色; 肠黏膜损伤程度按Chiu 6 级评分法[7]分析.一部分肝组织用来检测细菌移位; 另一部分小肠及肝组织用生理盐水洗 3 次,清除残血,用滤纸吸干,刮取肠黏膜组织及肝组织各0. 5 g,分别加入 40 ℃ 磷酸盐缓冲溶液 5 mL,在冷水中用匀浆机匀浆,3 500 r·min- 1离心 1 min,取上清,-70 ℃ 冰箱保存.采用硫代戊巴比妥酸法测定血清和组织匀浆中 MDA 含量,黄嘌呤氧化酶还原法测定血清和组织匀浆中 SOD 活性,比色法测定血清和组织匀浆中 MPO 活性.
1. 7 免疫组织化学检测肝组织内 NF-κB p65 表达按照 SABC 试剂盒说明书操作,取石蜡切片常规脱蜡至水,体积分数 3% H2O2灭活内源性过氧化氢酶,高压抗原修复,山羊血清封闭,滴加 1: 100 比例稀释的兔抗大鼠 NF-κB p65 一抗,4 ℃过夜后滴加山羊抗兔二抗,滴加 SABC 复合物,二氨基联苯胺显色,蒸馏水洗涤终止显色,苏木精复染、脱水、透明、封片,以磷酸盐缓冲液代替 I 抗孵育作为阴性对照.
高倍镜下细胞质内呈棕黄色或黄色的颗粒或团块为阳性细胞,观察片中 10 个具有代表性的高倍镜视野,计算 1 000 个肝细胞中染色阳性细胞数除以1 000 作为 NF-κB p65 表达阳性指数 ( positive in-dex,PI) ,并用数码相机成像.
1. 8 统计学处理 应用 SPSS 19. 0 统计软件进行分析,计量资料以均数 ± 标准差( x ± s) 表示,多组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析,两两比较采用 LSD 法,P <0. 05 为差异有统计学意义.
2 结果
2. 1 各组家兔血清中 TNF-α、IL-10、内毒素、MDA水平及 MPO、SOD 活性的变化 结果见表1.再灌注 2 h 后,IR 组家兔血清中 TNF-α、IL-10、内毒素水平显着高于 SO 组,差异有统计学意义( P < 0. 01) ;HO 组和 HI 组家兔血清中 TNF-α、内毒素水平显着高于 SO 组,但显着低于 IR 组,差异有统计学意义( P < 0. 05,P < 0. 01) ; HI 组家兔血清中 TNF-α、内毒素水平显着低于 HO 组,差异有统计学意义( P <0. 05,P < 0. 01) .HO 组和 HI 组家兔血清中 IL-10水平显着高于 IR 组,差异有统计学意义 ( P <0. 01) ; HO 组和 HI 组家兔血清中 IL-10 水平比较差异无统计学意义( P > 0. 05) .IR 组家兔血清中MPO 活性和 MDA 水平显着高于 SO 组,差异有统计学意义( P <0. 01) ; HO 组和 HI 组家兔血清中 MPO活性和 MDA 水平显着高于 SO 组,但显着低于 IR组,差异均有统计学意义( P < 0. 01) ; HI 组家兔血清中 MPO 活性和 MDA 水平显着低于 HO 组,差异有统计学意义( P < 0. 05,P < 0. 01) .IR 组、HO 组和 HI 组家兔血清中 SOD 活性显着低于 SO 组( P <0. 01) ,但 HO 组和 HI 组家兔血清中 SOD 活性均显着高于 IR 组( P < 0. 01) ,且 HI 组家兔血清中 SOD活性显着高于 HO 组( P <0. 01) .
2. 2 小肠黏膜病理改变及其 MDA 水平和 MPO、SOD 活性变化 光镜下 SO 组家兔小肠黏膜绒毛完整,无明显上皮下间隙扩张; IR 组家兔小肠黏膜可见绒毛破损,上皮细胞水肿明显,部分坏死脱落,固有层红细胞增多,少部分肠黏膜固有层破坏和溃疡;HO 组和 HI 组小肠黏膜绒毛损伤程度较 IR 组减轻,HI 组损伤程度较 HO 组轻; 见图 1.IR 组、HO组和 HI 组家兔肠黏膜损伤评分显着高于 SO 组( P <0. 01) ,HO 组和 HI 组家兔肠黏膜损伤评分显着低于 IR 组( P < 0. 01) ; HI 组家兔肠黏膜损伤评分显着低于 HO 组( P <0. 05) .IR 组家兔小肠黏膜组织中 MPO 活性和 MDA 水平显着高于 SO 组( P <0. 01) ; HO 组和 HI 组家兔小肠黏膜组织中 MPO 活性和 MDA 水平显着高于 SO 组( P < 0. 01) ,但显着低于 IR 组( P < 0. 01) ; HI 组家兔小肠黏膜组织中MPO 活性和 MDA 水平显着低于 HO 组( P < 0. 05) .IR 组、HO 组和 HI 组家兔小肠黏膜组织中 SOD 活性显着低于 SO 组( P < 0. 01) ; HO 组、HI 组家兔血清 SOD 活性均显着高于 IR 组( P < 0. 01) ; HI 组家兔小肠黏膜组织中 SOD 活性显着高于 HO 组( P <0. 05) ; 见表 2.
2. 3 各组家兔肝脏病理学改变及肝组织内 NF-κBp65 表达、MDA 水平及 MPO 和 SOD 活性的变化光镜下 SO 组家兔肝小叶结构完整,肝板排列整齐,血管内皮细胞无脱落,肝窦间隙正常,内皮细胞无脱落,肝细胞无变性坏死; IR 组家兔肝小叶结构不完整,肝板排列紊乱,肝细胞有不同程度的变性,胞核浓缩、深染,可见脱落的内皮细胞,伴有肝细胞点状坏死; HO 组和 HI 组家兔肝组织病理改变较 IR组轻,肝小叶结构尚完整,肝板排列比较整齐,偶见内皮细胞脱落,肝细胞变形坏死少见; 见图 2.无菌操作下分别切取肝组织进行细菌培养,发现 SO 组家兔肝组织均无细菌移位,IR 组家兔肝脏细菌移位率 100. 0%,HO 和 HI 组家兔肝脏细菌移位率均为83. 3% ,HO 和 HI 组家兔肝脏细菌移位率与 IR 组比较差异均无统计学意义( P >0. 05) .细菌培养结果显示主要细菌为大肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌,与小肠内细菌相同.IR 组、HO 组、HI 组家兔肝组织内 NF-κB p65 阳性表达显着高于 SO 组( P <0. 01) ,HO 组和 HI 组家兔肝组织内 NF-κB p65 阳性表达显着低于 IR 组( P <0. 01) ,HI 组家兔肝组织内 NF-κB p65 阳性表达显着低于 HO 组( P < 0. 05) ; 见图 3和表 3.再灌注 2 h 后,IR 组家兔肝组织中 MPO 活性及 MDA、ALT、AST 水平显着高于 SO 组( P <0. 01) ; HO 组和 HI 组家兔肝组织中 MPO 活性及MDA、ALT、AST 水平仍显着高于 SO 组( P < 0. 01) ,但显着低于 IR 组( P < 0. 01) ; HI 组家兔肝组织中MPO 活性及 MDA、ALT、AST 水平显着低于 HO 组( P <0. 05) .IR 组家兔肝组织中 SOD 活性显着低于 SO 组( P < 0. 01) ,HO 组和 HI 组家兔肝组织中SOD 活性仍低于 SO 组,但显着高于 IR 组 ( P <0. 01) ; HI 组家兔肝组织中 SOD 活性显着高于 HO组( P <0. 05) ; 见表 3.
3 讨论
高氧液可以不依赖于肺的气体交换功能,通过血液循环系统直接向组织供氧,迅速改善动脉血氧分压、组织氧分压以及细胞有氧代谢水平[8],持续灌注高氧液及高氧液预处理均可减轻心脏、肺脏的IRI.由于上述应用高氧液的方式只能在缺血之前进行,而临床中缺血的时机常不可预知,所以高氧液预处理与持续灌注的应用价值受到很大限制.IP是一种机械性干预措施,可以在缺血后施行,可操作性大,目前 IP 对心脏[9]、肝脏[10]IRI 的保护作用已取得进展,有研究发现 IP 与抗氧化剂联合对脏器IRI 的保护作用可能更强[11].MDA 是氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发过氧化作用形成的脂质过氧化物,可间接反映细胞损伤程度[12],MPO 是中性粒细胞胞质中的一种特异性酶,血清及组织中 MPO 活性可间接反映中性粒细胞浸润和激活的程度[13].SOD 是氧自由基清除剂,其活性降低可反映氧自由基的增多和细胞损伤的加重.本研究发现,肠 IRI 2 h 后,IR 组家兔血清和小肠、肝组织中 MDA 水平和 MPO 活性均比 SO 组显着升高,SOD 活性较 SO 组显着降低;表明 IRI 后小肠及肝组织脂质过氧化反应增强,中性粒细胞浸润增加,自身清除氧自由基能力减弱,引起组织及血液中氧自由基升高,抗氧化能力下降,加重组织损伤.本研究发现,HO 组和 HI 组家兔血清及小肠、肝组织 MDA 水平和 MPO 活性较 IR 组明显下降,SOD 活性较 IR 组明显升高,提示静脉应用高氧液和高氧液联合 IP 均能够提升小肠及肝脏的氧自由基的清除能力,减轻中性粒细胞浸润,启动了细胞内源性保护机制,进而提高抗氧化能力,减轻组织损伤,其中高氧液 IP 的清除自由基和抗氧化能力更强,其可能的机制是通过多次反复灌注/缺血使缺血的脏器血流恢复,减少了氧自由基底物,增加了组织的供氧,减少了氧自由基的生成,减轻脏器的损伤.
本实验还发现,再灌注 2 h 后,肠黏膜屏障受到损害,导致肠道细菌、内毒素移位,肠源性细菌及内毒素持续侵入门静脉以及肠源性炎性介质释放入血,激活炎性细胞,使肝脏受损,ALT、AST 水平急剧升高.肝细胞损伤进一步激活 Kupffer 细胞、中性粒细胞释放大量促炎因子和炎性介质,激活 NF-κB 信号通路,而活化的 NF-κB 可上调前炎性细胞因子TNF-α 的基因转录[14].TNF-α 是由激活的巨噬细胞、内皮细胞、中性粒细胞等分泌的具有多功能的多肽,在炎症反应过程中起着十分重要的作用[15].
TNF-α 可以诱导氧自由基产生,促进中性粒细胞产生氧自由基等活性氧递质并导致肝损伤[16].IL-10是由辅助性 T 淋巴细胞分泌的细胞因子,作为体内炎症反应过程中的内生性抗炎细胞因子,抑制 TNF-α,IL-1β 等多种炎症相关因子的产生[17].从炎性因子指标的变化及 NF-κB p65 的阳性表达变化方面推断,发生肠 IRI 后,血液中内毒素增加,抗氧化能力下降,氧自由基的清除能力下降,释放大量促炎因子和脂质炎性介质,激活 NF-κB 信号通路,上调TNF-α 水平,引起肝损伤.单独应用高氧液及高氧液联合 IP 均可以减少内毒素的释放,增强抗氧化能力,减少促炎因子和脂质炎性介质的释放,降低 NF-ΚB p65 的表达,抑制 NF-κB 信号通路调控的炎症级联反应,减轻肝损伤,但高氧液联合 IP 的保护作用明显优于单独应用高氧液.
综上所述,高氧液是一种高效抗氧化剂,单独应用高氧液和高氧液联合 IP 均可以减轻肠黏膜损伤,减少内毒素移位,减少氧自由基的生成,促进抗炎因子的激活,抑制 NF-κB 信号通路调控的炎症级联反应,减轻肝损伤.但高氧液联合 IP 的保护效果优于单独应用高氧液,其联合应用的保护机制仍需进一步研究,但高氧液联合 IP 可以为临床外科防治肠 IRI 所导致的多器官损伤治疗及预防提供新策略.
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