ApoE基因敲除对骨髓造血干细胞的影响分析

　　载脂蛋白 E( apolipoprotein E，Apo E) 是一种多态性蛋白，参与脂蛋白的转化与代谢过程，其基因可以调节多种生物学功能。Apo E 基因敲除后，小鼠的 B 淋巴细胞及 T 淋巴细胞发生改变，ApoE 在造血干祖细胞中表达丰富，Apo E 基因敲除小鼠喂饲高脂、高胆固醇饲料后，造血干祖细胞显着增多，这说明在高脂、高胆固醇可以诱导 Apo E基因敲除小鼠造血干祖细胞增殖。那么在没有高脂、高胆固醇诱因下，Apo E 基因对小鼠造血干祖细胞有没有影响呢?　　造血干细胞是所有成熟血细胞维持的重要因素。在生理状态下，造血干细胞面临多种命运选择: 自我更新、分化、凋亡、静息或迁移，这些选择之间的平衡决定了造血干细胞的功能。不同命运的选择是由内在( 细胞周期、凋亡等相关基因) 和外在( 微环境) 的调控机制共同决定的。但是造血干细胞维持自我更新和选择分化的具体机制还不清楚。　　那么 Apo E 对造血系统有怎样的作用，是否会影响骨髓造血干细胞( hematopoietic stem cell，HSC)的发育分化呢? 为了解 Apo E 基因敲除是否会影响HSC，我们应用 Apo E 基因敲除小鼠及同窝野生对照小鼠进行了相关分析。　　1 材料和方法　　1. 1 动物与设备　　Apo E 基因敲除小鼠来自北京协和医学院比较医学中心，遗传背景为 C57B6/L，对照小鼠为同窝野生型小鼠，动物生产及使用许可证号: SCXK( 京)2009 － 0007; SYXK ( 京) 2011 － 0022。动物饲养在SPF 动物房，喂饲 SPF 级小鼠维持饮料。主要实验设备为美国 BD 公司 Aria 流式细胞仪。　　1. 2 PCＲ 方法鉴定 Apo E 基因敲除小鼠基因型　　用 10 日龄小鼠尾尖提取基因组 DNA，普通PCＲ 鉴定基因型。反应条件: 94℃ 预变性 3 min;94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 30 s，35 个循环; 72℃ 延伸10 min。 基 因 敲 除 小 鼠 的 PCＲ 鉴 定 引 物:OIMＲ0180: 5` GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG 3`，OIMＲ 0181: 5` TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C3`，OIMＲ 0182: 5` GCC GCC CCG ACT GCA TCT 3`，PCＲ 产物长度，野生型为 155 bp，Apo E 敲除为 245bp，杂合子同时有上述 2 条片段。引物由上海英骏生物工程技术有限公司合成，PCＲ 试剂购自宝生物工程有限公司。　　1. 3 流式分析　　小鼠 2 月龄时脱颈椎处死，取外周血、胸腺、脾脏、后肢骨，置于冰上预冷的染色缓冲液( 含 1%BSA 的 PBS) 中。胸腺、脾脏用磨砂玻片研磨成细胞悬液; 后肢骨用 5 mL 注射器将骨髓细胞冲出，并吹打成细胞悬液。将细胞悬液用 50 μm 尼龙滤膜过滤后收集到 15 mL 离心管中，用 PBS 定容至10 mL，混匀后，取 10 μL 细胞悬液，稀释 10 倍后计数细胞数。细胞悬液离心，1000 r/min，10 min，将细胞浓度调整为 1 ×108个细胞/mL。分别取 106细胞标记荧光抗体( BD 公司) 。　　骨髓造血干细胞的分析中用如下抗体进行标记: CD34-FITC、Flt3-PE、CD16/32- Pcrcp-cy5. 5、Sca1- PE-Cy7、cKit- APC、Ter-119- Biotin、Gr-1-Biotin、Mac-1- Biotin、B220- Biotin、IL-7Ｒ- Biotin、CD4- Biotin、CD8- Biotin、Biotin - APC-Cy7。骨髓造血干细胞( HSC) 表面标记为: lin-c-kit+sca1+，长期造血干细胞 ( LT-HSC) 表面标记为: Lin- c-Kit+Sca1+CD34-Flt3－，短期造血干细胞( ST-HSC) 表面标记为: Lin-c-Kit+Sca1+CD34+Flt3－，髓系祖细胞( MP) 表面标记为: Lin-c-Kit+Sca1－，共同髓系祖细胞( CMP) 表 面 标 记 为: Lin- c-Kit+Sca1－CD34+CD16 /32low，粒单系祖细胞( GMP) 表面标记为: Lin-c-Kit+Sca1－CD34+CD16 /32high，巨核单系祖细胞( MEP) 表面标记为: Lin-c-Kit+Sca1－CD34－CD16 /32low，淋系共同祖细胞( CLP) 的表面标记为: Lin-c-kitlow Sca1lowCD34+IL － 7Ｒ+。IgD-FITC、CD43-PE、B220-PE-Cy7、IgM-APC，标记不同发育阶段的 B 淋巴细胞。脾脏及外周血细胞标记抗体: CD4-FITC、CD8- Pcrcp-cy5. 5、B220-PE-Cy7、CD11B- APC-Cy7。　　上述抗体加入细胞悬液，冰上避光，30 min; 加 1 mL染色缓冲液，离心，2600 r/min，5 min，弃上清，加200 μL 染色缓冲液重悬细胞，用 50 μm 尼龙滤膜过滤，冰上避光备用。　　1. 4 统计分析方法　　数据分析采用 SPSS13. 0 软件包进行统计分析，各组数据均采用 x珋 ± s 表示。组间资料分析采用 t检验。以 P ＜ 0. 05 表示差异有统计学意义。　　2 结果　　2. 1 PCＲ 鉴定结果　　剪取 10 日龄小鼠脚趾，采用饱和氯化钠法提取小鼠基因组 DNA，进行 PCＲ，产物经2%琼脂糖凝胶电泳，野生型产物长度为 155 bp，Apo E 缺失产物长度 245 bp。基因型鉴定结果( 图 1) 。　　2. 2 Apo E 基因敲除小鼠外周血 B 细胞、T 细胞减少　　我们取 Apo E 基因敲除小鼠及同窝野生对照小鼠的外周血进行分析，发现 Apo E 基因敲除小鼠外周血中 B220+细胞( P ＜ 0. 05) 及 T 淋巴细胞( P ＜0. 01) 显着减少，而 CD11b+细胞则没有显着变化( P＞ 0. 05) 。　　2. 3 Apo E 基因敲除对小鼠骨髓及脾脏中 B220+细胞的影响Apo E 基因敲除小鼠外周血中 B220+细胞减少，本研究对骨髓及脾脏的细胞进行了分析，同时对骨髓中前体 B 细胞的发育也进行了分析。结果发现，Apo E 基因敲除小鼠脾脏 B220+细胞减少( P＜ 0. 05) ，但是骨髓中 B220+细胞无显着改变( P ＞0. 05) 。同时，骨髓中前体 B 细胞的发育也没有显着变化( P ＞0. 05) 。　　2. 4 Apo E 基因敲除小鼠 T 细胞变化　　Apo E 基因敲除小鼠外周血 T 淋巴细胞减少，为了解骨髓及脾脏 T 淋巴细胞的变化，本研究分析了骨髓、脾脏中 CD4+、CD8+细胞。结果发现，脾脏中 CD4+细胞比例增多( P ＜0. 01) ，而 CD8+细胞比例降低( P ＜0. 05) ; 骨髓中则未发现显着变化( P ＞0. 05 图 4A) 。为进一步了解 Apo E 基因敲除对小鼠 T 淋巴细胞发育的影响，我们分析了胸腺 T 淋巴细胞，结果显示，各阶段 T 淋巴细胞的比例没有显着变化( P ＞0. 05) 图4B) 。这说明，Apo E 基因敲除对 T 淋巴细胞发育没有显着影响。　　2. 5 Apo E 基因敲除对骨髓造血干细胞的影响　　为了解 Apo E 基因敲除对小鼠骨髓造血干细胞的影响，本研究分析了 Apo E 基因敲除小鼠及同窝野生对照小鼠骨髓造血干细胞的数量，发现 Apo E基因敲除小鼠短期造血干细胞( ST-HSC) 数量显着增加( P ＜ 0. 05) ，长期造血干细胞( LT-HSC) 、多潜能造血祖细胞( MPP) 及淋系共同祖细胞( CLP) 则没有显着变化( P ＞0. 05) 。造血干细胞的功能是否改变，则需进行骨髓移植实验来深入研究。　　3 讨论　　已有研究表明，Apo E 基因参与免疫调节作用，Apo E 基因敲除小鼠的体液免疫及细胞免疫均发生改变。Apo E 基因敲除小鼠在 3 月龄时已出现脂肪条纹，即动脉粥样硬化早期的损伤性表现。本研究中采用 2 月龄小鼠作为研究对象喂饲正常小鼠维持饲料，避免了 Apo E 基因敲除所致疾病对研究目标的影响。本研究发现，Apo E 基因敲除后小鼠造血系统 B220+、CD4+、CD8+淋巴细胞在外周组织中发生变化，骨髓短期造血干细胞显着增加( P ＜0. 05) ，但是骨髓长期造血干细胞及胸腺 T 细胞则没有显着变化( P ＞0. 05) 。这说明 Apo E 基因可能通过免疫调节作用影响 B220+、CD4+、CD8+淋巴细胞。Apo E 基因对骨髓造血干细胞的自我更新及分化功能是否有影响，尚需应用竞争性骨髓移植、体外克隆形成实验等进一步深入研究。　　参考文献:　　［1］ Ｒeue KL，Quon DH，O ＇Donnell KA，et al． Cloning andregulation of messenger ＲNA for mouse apolipoprotein E． TheJournal of biological chemistry ［J］． 1984， 259 ( 4 ) : 2100－ 2107．　　［2］ Ali K，Middleton M，Pure E，et al． Apolipoprotein E suppressesthe type I inflammatory response in vivo． Circulation research［J］． 2005，97( 9) : 922 －927．　　［3］ Murphy AJ，Akhtari M，Tolani S，et al． ． ApoE regulateshematopoietic stem cell proliferation，monocytosis，and monocyteaccumulation in atherosclerotic lesions in mice． The Journal ofclinical investigation［J］． 2011，121: 4138 － 4149．　　［4］ Kobayashi M，Srour EF． Ｒegulation of murine hematopoieticstem cell quiescence by Dmtf1． Blood［J］． 2011，118: 6562－ 6571．　　［5］ Pietras EM，Warr MＲ，Passegue E． Cell cycle regulation inhematopoietic stem cells． The Journal of cell biology［J］． 2011，195: 709 － 720．［6］ Laskowitz DT，Lee DM，Schmechel D，et al． ． Altered immuneresponses in apolipoprotein E-deficient mice． Journal of lipidresearch［J］． 2000，41: 613 － 620．