MT01注入大鼠主要脏器组织观察其分布规律

　　ＭＴ０１是模拟人类线粒体ＤＮＡ设计的单链寡脱氧核苷酸（ｏｌｉｇｏｄｅｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＯＤＮ）序列，含有２７个碱基，其富含胞嘧啶Ｃ，每９个碱基序列中含有５个连续的碱基Ｃ。２００９年Ｙａｎｇ等证实ＭＴ０１具有强免疫活性，并指出ＭＴ０１有潜力作为一种新型的免疫抑制性ＯＤＮ来治疗Ｔｏｌｌ样受体（ＴＬＲ）激活相关的疾病。本课题组前期研究［２］显示：ＭＴ０１能够诱导成骨细胞分化并增殖，促进成骨细胞表达成骨相关因子；体外实验观 察 到ＭＴ０１能够以胞吞作用进入ＭＧ６３成骨样细胞系。　　以往国内外对ＯＤＮ的实验研究多采用静脉、皮下或腹膜下注射等方式，而本课题组前期体内实验研究均采用牙龈黏膜下局部注射ＭＴ０１的方式，在大鼠正畸牙移动实验中观察到ＭＴ０１能够减少压力侧牙槽骨表面破骨细胞的数量，增加牙周膜中Ⅰ型胶原的表达水平，减少核因子κＢ受体活化因子配体 （ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ－κＢｌｉｇａｎｄ，ＲＡＮＫＬ）的表达水平；此外ＭＴ０１能够显着减少牙周炎大鼠牙槽骨的吸收水平。鉴于目前采用牙龈黏膜下局部注射的研究少有报道，本研究采用牙龈黏膜局部注射后，观察ＭＴ０１进入大鼠主要脏器组织及其在各组织中的分布规律，为进一步研究开发ＭＴ０１在牙周局部应用奠定实验基础。　　１材料与方法　　１．１　实验动物、主要试剂和仪器　６０只 Ｗｉｓｔａｒ大鼠购自吉林大学实验动物中心，动物许可证号：ＳＣＸＫ（吉 ）２００８－０００５；ＯＤＮ　ＭＴ０１， 序 列５′－ＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＣＣＣＣＣＴＣＴ－３′，由吉林大学 基础医学院分子生物学教研室自主设计，生工生物工程上海股份有限公司合成，全硫代修饰，５′端标记Ｃｙ５；速眠新购自吉林省华牧动物保健品有限公司；激光共聚 焦显微镜 （Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＩＸ８１，日本），快速冰冻切片机 （ＬＥＩＣＡ　ＣＭ１８５０公司，德国），Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３２５８（碧云天，中国），赖氨酸附膜载玻片（武汉博士德公司，中国），盖玻片、ＯｌｙｍｐｕｓＦＶ１０－ＡＳＷ　１．７ Ｖｉｅｗｅｒ软 件 和Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　ＯｆｆｉｃｅＥｘｃｅｌ　２００３软件。　　１．２　实验动物分组　ＳＰＦ级健康雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠６０只，体 质 量 为 （２００±１０）ｇ，随 机 分 为 注 射ＭＴ０１的对照组和注射Ｃｙ５标记ＭＴ０１的实验组，每组３０只。然后按时间点随机分为１５ｍｉｎ、１ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ、１ｄ、２ｄ、３ｄ、４ｄ和５ｄ组，每组３只。　　１．３　注射方式和注射剂量各组大鼠均适应性喂养１周。乙醚浅麻后，实验组、对照组大鼠于右侧上颌第一恒磨牙颊侧牙龈黏膜下分别注射Ｃｙ５标记和 未 荧 光 标 记 的ＭＴ０１　２μｇ（２０ ｍｇ·Ｌ－１，０．０１ｍｏｌ·Ｌ－１ＰＢＳ稀释），分别于注射后１５ｍｉｎ、１ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ、１ｄ、２ｄ、３ｄ、４ｄ和５ｄ在全麻下取实验组大鼠肺、肝、脾、肾、心和脑组织。　　１．４　快速冰冻切片的制备和观察各组织修块，快速冰冻切片机切片， 每个组织３张， 厚度１０μｍ。 室温下干 燥， 甲 醛 固 定１５ ｍｉｎ，０．０１ｍｏｌ·Ｌ－１ＰＢＳ冲 洗，Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３２５８染 色３～５ｍｉｎ，０．０１ｍｏｌ·Ｌ－１ＰＢＳ冲洗，９０％甘油封片，４℃避光保存。激光共聚焦显微镜观察各组织切片并拍照，每张切片随机取３张图像。形态学观察ＭＴ０１在各脏器组织中的分布状况，以荧光阳性细胞率表示ＭＴ０１进入各组织细胞量。荧光阳性细胞率＝单个计数区域内荧光阳性细胞数／区域内总细胞数。计数方法：每张图像平均分为９个区域，随机选择３个区域计数，取平均值作为图像的荧光阳性细胞率。　　１．５　统计学分析每组选择３张图像，应用ＦＶＶｉｅｗｅｒ　１．７软件对图像计数，选择３名非实验相关人 员 分 别 计 数。 应 用Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｏｆｆｉｃｅ　Ｅｘｃｅｌ２００３软件计算各组织荧光阳性细胞率并以ｘ±ｓ表示。　　２结果　　２．１　形态学观察荧光阳性细胞的细胞核表现为蓝色荧光，胞质表现为红色荧光。对照组未观察到荧光阳性细胞；实验组大鼠肺、肝、脾和肾组织细胞中均能观察到Ｃｙ５标记ＭＴ０１的荧光分布（图１Ａ～Ｄ，见插页三）；心、脑组织细胞中未见明显的荧光分布（图１Ｅ和Ｆ，见插页三）。肾组织中荧光阳性细胞呈片状分布，荧光主要集中于肾小管上皮细胞的胞质中，肺、肝、脾组织中仅见少量散在分布的荧光阳性细胞。　　２．２实验组各脏器组织中荧光阳性细胞率ＭＴ０１较早进入脾组织中，进入肺、肾和肝组织相对较晚。肝、脾和肾组织中的荧光阳性细胞率分别在注射ＭＴ０１　３、１和２ｄ后呈先增高后降低的趋势，峰值分别出现在注射后４、３和４ｄ；肺组织的荧光阳性细胞率随时间变化无明显规律性。肾组织的荧光阳性细胞率最大，肺、肝和脾组织的荧光阳性细胞率相对较小。见表１.　　　３讨论　　本课题组前期体内实验观察到ＭＴ０１具有显着促进大鼠牙周组织成骨的作用，提示ＭＴ０１有可能作为一种新型的促牙槽骨组织再生的生物制剂应用于口腔临床，因此了解ＭＴ０１在牙周组织中与非目标组织中的相对积聚量、代谢和清除特点、清除率及毒性等有重要意义。　　目前已有大量实验采用静脉、皮下及腹膜下注射等方式研究ＯＤＮ的代谢及生物分布，但鲜有文献报道口腔黏膜局部注射后ＯＤＮ的代谢及生物分布情况。口腔黏膜局部给药具有避免肝脏首过效应、药物利用率高、不良反应轻、致敏性小和组织修复快等优点，是口腔临床用药过程中较为常见的途径。本实验应用前期体内实验中牙龈黏膜的注射方式，观察到一定量的ＭＴ０１能够随血液循环进入大鼠的肺、肝、脾和肾组织中，且大鼠吸收ＭＴ０１后分布到各脏器组织存在着时间的差异性。　　关于ＭＴ０１在大鼠体内主要脏器中的分布特点，目前许多研究表明：ＯＤＮ在大鼠各脏器组织中的分布存在差异性，且分布特征又具有一定相似性。　　ＯＤＮ在肾、肝、脾组织中分布量较多，而在肺、脑、心的分布量较少。本实验中肾脏组织的荧光阳性细胞率明显高于其他脏器组织，荧光主要集中于肾小管上皮细胞内，肾小球未见明显的荧光分布，表明肾脏可能是ＭＴ０１的主要代谢器官。　　Ｌｅｎｄｖａｉ等采用６８Ｇａ标记ＰＳ－ＯＤＮ经大鼠尾静脉注射后，观察到放射线最强处集中在肾脏的皮质区。也有研究报道：经小鼠尾静脉注射ＦＩＴＣ标记、硫代磷酸化修饰的反义寡核苷酸后，肾脏可见大量荧光沉积，肝、脾和肺仅见少量散在、细小的荧光分布，这与本实验研究结果一致。　　Ｈｊｅｌｓｔｕｅｎ等研究表明：尿液及膀胱中的ＯＤＮ水平较高，认为尿液是ＯＤＮ的主要排泄途径。另有研究［９－１０］显示：肝脏也是ＯＤＮ主要分布的脏器之一。 李东良等研 究 表 明： 小 鼠 静 脉 注 射３Ｈ－ｃ－ＭｙｃＡＳ－ＰＳ－ＯＤＮ　０．５ｈ后，肝、脾和肺中均观察到较高浓度３Ｈ－ｃ－ＭｙｃＡＳ－ＰＳ－ＯＤＮ分布，与本实验结果不同。关于不同ＯＤＮ体内分布差异性的影响因素，目前尚无定论。　　Ａｍａｎｔａｎａ等认为：与ＰＳ－ＯＤＮｓ相似，二胺吗啉代寡核苷酸（ＰＭＯｓ）的分布模式不依赖于本身的序列、长度及给药方式，而ＰＭＯｓ的清除却与时间和组织有关，还指出给药途径，如静脉注射、口服、腹膜下注射、皮下注射 或 经 皮 肤、经 肺 给 药，均 得 到 了 相 似 的ＰＭＯｓ代谢特征。　　李东良等指出：静脉注射反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸后，其在亲脂性器官中分布少，如脑和生殖器等。本实验在脑组织中未观察到荧光分布，其可能与血脑屏障有关。血脑屏障是介于血液和脑组织之间的屏障结构，主要的形态学基础是紧密连接的毛细血管内皮细胞，其对血液中的物质具有高度的选择透过性，只允许亲脂性和相对分子质量小于６００的分子通过。磷酸二酯和硫代磷酸寡脱氧核苷酸为５～１０ｋＤａ的多聚阴离子分子，不能够通过血脑屏障。本实验中ＭＴ０１的相对分子质量为８　３２５．６３，以０．０１ｍｏｌ·Ｌ－１ＰＢＳ缓冲液稀释。推测ＭＴ０１的相对分子质量和亲水性是影响其进入脑组织的可能因素。　　ＯＤＮ与细胞组分的非专一性结合及其降解产物是导致ＯＤＮ毒性的２个主要方面。目前研究认 为： 适 当 浓 度ＯＤＮ是 低 毒 性 的。Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ等认为：低 剂 量ＰＳ－ＯＤＮ无 毒 性，但口服给药是危险的，长时间应用较高剂量ＰＳ－ＯＤＮ可能导致肾脏损伤。　　Ｈａｎａｇａｔａ也指出硫代磷酸化ＯＤＮ能引起肾脏损伤。刘红等认为：虽然ＰＳ－ＯＤＮ是低毒性的，但其抑制细胞分化，在许多细胞系中，使用较高的非治疗浓度充当细胞静止剂。本实验观察到ＭＴ０１在肾脏组织中的分布量大于其他组织，且ＭＴ０１能够抑制由ＣｐＧ　ＯＤＮ等免疫刺激因素诱导的免疫反应，这就有必要了解ＭＴ０１的毒理性。牙龈黏膜局部注射ＭＴ０１后对大鼠正常脏器组织，尤其是肾脏组织是否有影响还有待今后的深入研究。　　［参考文献］　　［１］Ｙａｎｇ　Ｇ，Ｗａｎ　Ｍ，Ｚｈａｎｇ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｃ－ｒｉｃｈｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｅ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｉｎ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１０，１３１（４）：５０１－５１２．　　［２］Ｆｅｎｇ　Ｚ，Ｓｈｅｎ　Ｙ，Ｗａｎｇ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ａｎ　ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｗｉｔｈ　ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ　ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｓｃｉ，２０１１，１２（４）：２５４３－２５５５．　　［３］Ｈｏｕ　Ｘ，Ｓｈｅｎ　 Ｙ，Ｚｈａｎｇ　 Ｃ，ｅｔ　 ａｌ． Ａ　 Ｓｐｅｃｉｆｉｃｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓｖｉａ　ＥＲＫ　ａｎｄ　ｐ３８ ＭＡＰＫ　ｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｓｃｉ，２０１２，１３（７）：７９０２－７９１４．　　［４］Ｌｅｎｄｖａｉ　Ｇ，Ｖｅｌｉｋｙａｎ　Ｉ，Ｂｅｒｇｓｔｒ?ｍ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆ　６８Ｇａ－ｌａｂｅｌｌｅｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ，ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ，ａｎｄ　２′－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｒａｔｓ［Ｊ］．ＥｕｒＪ　Ｐｈａｒｍ　Ｓｃｉ，２００５，２６（１）：２６－３８．　　［５］Ａｍａｎｔａｎａ　Ａ，Ｉｖｅｒｓｅｎ　 ＰＬ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ　 ａｎｄｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ　ａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｍｅｒｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００５，５（５）：５５０－５５５．　　［６］Ｇｏｏｄａｒｚｉ　Ｇ，Ｗａｔａｂｅ　Ｍ，Ｗａｔａｂｅ　Ｋ．Ｏｒｇａｎ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｄ　ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｉｎｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｐｈａｒｍ　Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｐｏｓ，１９９２，１３（３）：２２１－２２７．　　［７］王静．特定寡核苷酸对大鼠实验性牙移动骨改建影响作用的研究［Ｄ］．长春：吉林大学，２０１１．　　［８］ＳｈｅｎＹ，Ｆｅｎｇ　Ｚ，Ｌｉｎ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ａｎ　ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｔｈａｔｉｎｄｕｃｅｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓｔｏ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｒｅｄｕｃｅｓ　ａｌｖｅｏｌａｒ　ｂｏｎｅ　ｌｏｓｓ　ｉｎ　ｒａｔｓｗｉｔｈ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｓｃｉ，２０１２，１３（３）：２８７７－２８９２．　　［９］Ｎｏｌｌ　ＢＯ，ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ　ＭＪ，Ｓｎｉａｔａｌａ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ　ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＣＰＧ　７９０９ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ａｎｄ　ｒａｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００５，６９（６）：９８１－９９１．　　［１０］Ｈｊｅｌｓｔｕｅｎ　ＯＫ，Ｔ?ｎｎｅｓｅｎ　ＨＨ，Ｂｒｅｍｅｒ　ＰＯ，ｅｔ　ａｌ．３′－９９ｍＴｃ－ｌａｂｅｌｉｎｇ　 ａｎｄ　 ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　 ｏｆ　 ａ　 ＣＡＰＬ　 ａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ［Ｊ］．Ｎｕｃｌ　Ｍｅｄ　Ｂｉｏｌ，１９９８，２５（７）：６５１－６５７．　　［１１］柳祎，孙宗全．细胞间粘附分子－１反义寡核苷酸在小鼠体内的分布及其作用［Ｊ］．华中科技大学学报：医学版，２００５，３４（２）：２０６－２０９．　　［１２］李东良，吕联煌，林景娟，等．新型ｃ－Ｍｙｃ反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸在小鼠体内的药动学［Ｊ］．中国新药与临床杂志，２００４，２３（３）：１３６－１３８．　　［１３］陈艳明，王宁生．冰片对血脑屏障体外模型细胞间紧密连接和细胞吞饮囊泡的影响 ［Ｊ］．中国中西医结合杂 志，２００４，２４（７）：６３２－６３４．　　［１４］Ｂｏａｄｏ　ＲＪ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒ［Ｊ］．Ａｄｖ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅｖｉ，１９９５，１５（１）：７３－１０７．［１５］Ｂｒｉｇｈｔｍａｎ　ＭＷ． Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ［Ｊ］．Ｅｘｐ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ，１９７７，２５（Ｓｕｐｐｌ）：１－２５．　　［１６］刘红，魏东芝．反义硫代磷酸酯寡聚核苷酸及其应用研究进展［Ｊ］．国外医学：输血及血液学分册，１９９７，２０（３）：１３３－１３６．　　［１７］Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ　ＳＫ，Ｉｖｅｒｓｅｎ　Ｐ．Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄ　ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ［Ｊ］．Ｊ　ＣｌｉｎＬａｂ　Ａｎａｌｙ，１９９５，９（２）：１２９－１３７．　　［１８］Ｈａｎａｇａｔａ　Ｎ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆＣｐＧ　ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｉｎｔ　ＪＮａｎｏｍｅｄ，２０１２（７）：２１８１－２１９５．