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探讨ET-1能否引起大鼠心肌自由基含量的增高

来源:杂志发表网时间:2015-12-20 所属栏目:基础医学

  

  内皮素-1(endothelin-1,ET-1)是心血管系统中ET的主要形式,可由内皮细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞、肝细胞和星形胶质细胞等合成。ET-1在心律失常、慢性心力衰竭、动脉粥样硬化等多种心血管疾病发病中都起着重要作用。氧自由基是机体内氧分子的不完全代谢产物,在缺血、缺氧等应激刺激下,可导致氧自由基生成过多或清除能力减弱,体内积累过多的氧自由基可对体内大分子物质产生毒害,直接或间接导致心血管疾病的发生。此前我们已报道超氧化物歧化酶(superoxidedismutase-1,SOD-1)能明显减轻ET-1引起大鼠心律失常,本实验应用电子自旋共振(ESR)方法经大鼠检测冠状动脉口注射外源性ET-1后对大鼠心肌氧自由基含量的影响,以明确ET-1能否引起大鼠心肌自由基含量的增高。

  1、材料与方法

  1.1实验材料

  1.1.1动物Sprague-Dawley大鼠30只,雄性,体重(200±20)g,由北京大学医学部实验动物中心提供。

  1.1.2仪器E-200电子自旋共振仪(X波段,德国Brucker公司)。

  1.1.3试剂ET-1(日本大阪肽研究所公司);超氧化物歧化酶(SOD-1,南京建成生物公司)。

  1.2实验方法

  1.2.1分组30只雄性SD大鼠,随机分为3组,每组10只。ET-1组:冠状动脉口注射1.5μmol·L-1的ET-1900pmol·kg-1;SOD-1+ET-1组:冠状动脉口注射SOD-10.6mg·kg-14min后,再注射1.5μmol·L-1的ET-1900pmol·kg-1(各组大鼠ET-1的注射剂量均为0.6mL·kg-1);对照组:冠状动脉口注射生理盐水0.6mL·kg-1。

  1.2.2冠状动脉口注射[6]大鼠用20%尿酯6mL·kg-1腹腔注射麻醉,仰卧位固定,气管插管,分离右侧颈总动脉。然后经右颈总动脉插管,管尖端开口达冠状动脉口,术后作冠状动脉口定位,插管末端距冠状动脉口0.5mm为正确位置,沿此管注射药物,见图1。

  

  1.2.3心肌标本冠状动脉口注射ET-110min后立即开胸取左心室心肌约300mg剪成细条,装入内径4mm的塑料管中,填长3cm放置液氮在10min内ESR检测。自心肌取材至放入液氮冻藏时间平均为15s。

  1.2.4ESR测试ESR用E-200波谱仪测试。

  先将样品放入谐振腔,温度调至100K,待温度平衡后记录ESR波谱。测试条件:X-波段,微波功率分别为5、10、20mW,微波频率9.172GHz,100kHz高频调制,调制幅度2.5G,滤波时间常数0.128s,扫场宽度500G。各信号峰g值计算:g=νh/βH=0.714484×ν/H(ν:微波频率;h:普朗图常数;H:磁场强度;β:玻尔磁子)。

  1.2.5ESR谱分析采用两种方法,一是取各组O峰绝对幅度作比较,二是取各组O/S比值,O、S波均取波峰至后波谷绝对幅度表示。

  1.3统计学方法

  用SPSS11.0统计软件进行分析。实验数据均以(x珋±s)表示,数据处理采用组间单因素方差分析法比较,P≤0.05为差异有统计学意义。

  2、结果

  2.1各组大鼠心肌ESR波谱各组ESR波谱

  自左向右主要由O、S、T三个波峰组成,经计算其中S峰g值为2.008,T峰g值为1.937,分别与半醌自由基及过渡金属离子的g值相近。因此,S峰可认为是半醌自由基信号,T峰为过渡金属离子信号,O峰g值为2.024与氧中心自由基g值相似,O峰为氧自由基信号,见图2。各组测量值见表1。从表中可看出,①O峰:ET-1组心肌氧自由基O峰明显高于对照组及SOD-1+ET-1组(P<0.05),而SOD-1+ET-1组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);②O/S比值:ET-1组与对照组及SOD-1+ET-1组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。表明冠状动脉口注射ET-1后,大鼠心肌氧自由基含量明显增多,提示有激发自由基释放作用,同时也进一步证明SOD-1具有清除氧自由基的作用。

  

  2.2ET-1组大鼠心肌在不同微波

  频率下的ESR波谱改变微波功率对O峰和S峰幅度的影响结果见图3。O峰的饱和功率远大于S峰的,这一现象与氧自由基ESR信号的饱和功率高和半醌自由基ESR信号饱和功率低相一致,进一步证明本实验所获及的O峰可能代表活性氧自由基。

  

  3、讨论

  自由基是指那些最外电子层具有不成对电子的分子、原子、离子和基团。自由基一般反应性较强,因而其寿命一般较短,如氧自由基。但也有少数自由基,反应性并不强,寿命也较长,在通常环境中具有一定的稳定性,如醌类自由基,这些自由基常被用做自旋标记物。氧自由基具有顺磁性和很高的反应活性,其测定方法主要有电子自旋共振法、比色法和电化学法等。

  ESR又称电子顺磁共振(electronparamagnet-icresonance,EPR),是研究电子自旋能级跃迁的一门学科,主要用来研究具有未成对电子结构的自由基、原子、分子(包括三线态分子),且不会对自由基产生破坏作用,是检测顺磁性、相对稳定的自由基最直接最有效的方法。

  本实验采用ESR方法检测了心肌自由基含量,给大鼠冠状动脉口注射ET-1后,O峰明显上升降,而相应半醌自由基的S峰基本保持不变,即代表氧自由基含量的O峰与O/S比值增大,明显高于对照组,表明ET-1有激发心肌细胞产生氧自由基作用。为了进一步证实上述实验中所得ESR波谱中相应O峰是氧自由基,我们使用了超氧阴离子特异清除剂SOD。超氧阴离子自由基在SOD的作用下生成H2O2,H2O2又在过氧化氢酶的作用下最终生成对人体无害的物质———H2O和O2,从而彻底清除超氧阴离子自由基。本实验结果表明SOD-1+ET-1组的O峰降低、O/S比值下降,均明显低于ET-1组,说明注入SOD后氧自由基成分(含量)减少。外源性ET-1可以降低SOD活性,从而导致心肌氧自由由基升高,其具体机制尚需进一步研究。  参考文献:  [1] Yanag Sawa M,Kurihara H,Kimura S,et al. A novelpotent constrictor peptide produced by vascular endo-thelial cell [J]. Nature,1988,322( 31) : 411 - 415.  [2] 刘镇,曾纪斌,古春花,等. 高血压患者脉压差变化与 CRP、ET -1 的相关性[J]. 临床医学工程,2012,19( 8) : 1280 - 1281.  [3] Ren AJ,Yan XH,Lu Hong,et al. Antagonism of in-hibits hypoxia - induced apoptosis in cardiomyocytes[J]. Can J Physiol Pharmacol,2008,86: 536 -540.  [4] 蔡志福,陈铭伍,冼磊. 氧自由基与心肌保护[J]. 广西医学,2010,32( 2) : 226 -228.  [5] 袁文俊,戎伟芳,严云,等. 超氧化物歧化酶拮抗内皮素所致大鼠和猫的心律失常[J]. 第二军医大学学报,1996,17( 6) : 539 -541.  [6] 袁文俊,许金廉,蒋应明,等. 大鼠冠状动脉口注射定位 方 法[J]. 第 二 军 医 大 学 学 报,1995,16( 6) : 569.  [7] 赵保路. 电子自旋共振技术在生物和医学中的应用[M]. 合 肥: 中 国 科 学 技 术 大 学 出 版 社,2009:21 - 25.  [8] Pan YM,Zhang XP,Zhu JC,et al. Separation and ac-tivity of antioxidant components from polygonum cuspi-datum[J]. Fine Chem,2005,22( 11) : 835 - 837.  [9] Guo YL,Li C,OU LC,et al. Analysis and studies onthe capability of resistance to oxidation of phyllanthusemblica L[J]. Journal Honghe University ,2004,2( 6) : 10 -14.  [10] Zhao Baolu. Applications of electron spin resonance inbiology and medicine[J]. Chinese Journal of Mag-netic Resonance,2010,27( 1) : 51 - 64.  [11] Ren AJ,Yuan X,Lin L,et al. Effects of endothelin -11 - 31 on cell viabililty and [Ca2 +]( i) in culturedneonatal rat cardiomyocytes[J]. Physiol Res,2008,57: 373 - 378.

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