探讨apo(a)NR基因多态性在蒙古族CHD病人中的分布

　　脂蛋白(a)(Lp(a))是心血管疾病的独立危险因子，其由蛋白质和脂类物质两部分组成，其中脂类物质与低密度脂蛋白(LDL)相似，主要为胆固醇，而蛋白质部分由apoB－100和apo(a)通过二硫键共价结合而成。apoB－100蛋白疏水性极强，部分被包埋于Lp(a)颗粒内部，分子量无明显个体差异，而apo(a)基因具有多态性，且其表型具有地区种族差异性、受遗传基因控制、每一个个体的基因型是终身固定的，不会因身体状况而发生改变，因此apo(a)的基因型决定了Lp(a)的特性。研究发现，位于apo(a)基因启动子区域上游信号序列存在一段五核苷酸重复序列(TTTTA)(pentanucleo－tiderepeat，PNＲ)。目前，对apo(a)PNＲ基因多态性与冠心病的关系，国内外研究结果并不一致。　　　　本研究旨在探讨apo(a)PNＲ基因多态性在蒙古族CHD病人中的分布情况及特点。　　　　1 研究对象　　　　研究对象来源于赤峰学院第一附属医院、赤峰市医院冠脉造影明确诊断为CHD的三代直系亲属均为蒙古族的病人，共计71例，平均年龄为55．63±10．38岁。正常对照选自在校蒙古族学生、中心血站正常献血蒙古族人员及医院体检未患动脉粥样硬化、肝脏疾病、糖尿病及癌症的的三代直系亲属也均为蒙古族的健康人群，共计66例，平均年龄30．20±6．87岁。　　　　2 研究方法　　　　2．1 血脂水平的测定　　　　采集清晨空腹受检者EDTA－Na2抗凝静脉血4mL，及时分离血浆，密闭－20℃以下冰箱保存，五天内进行检测。血浆Lp(a)测定使用免疫透射比浊法，用北京中生生物工程公司试剂盒。为确保测定结果可靠，每批标本测定均做标准曲线，同时做质控。血浆TG、TC测定选用酶学终点分析法。血浆HDL－C采用磷钨酸－镁沉淀法进行测定，血浆LDL－C采用聚乙烯硫酸盐沉淀法进行测定。　　　　2．2 PCＲ扩增　　　　血细胞经过0.2%的氯化钠低渗溶液破碎红细胞后，用北京百泰克生物技术有限公司的细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。　　　　引物设计参照BoHu等设计，由北京三博远志生物技术有限责任公司合成，序列为:5'－GAATTCATTTGCGGAAAGATTG－3'和5'－CT-TCAACCGGGGTGAGAGTCTC－3'。特异性扩增apo(a)5'端调控区信号密码子上游1373bp处的(TTTTA)n五核苷酸串联重复序列。　　　　PCＲ扩增条件:94℃预变性90s，以下程序循环35次，94℃变性40s，60℃退火30s，72℃延伸40s，最后72℃再延伸5min，4℃保存。取产物2．5μL经3%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。　　　　2．3 apo(a)PNＲ基因多态性的检测　　　　按照丙烯酰胺:N、N'－甲叉双丙烯酰胺50∶2．5的比例配制10%的聚丙烯酰胺凝胶。150V预电泳30min，加样1．5μL后再150V于4℃电泳10h。电泳结束后，凝胶首先在10%醋酸溶液中固定10min，蒸馏水冲洗1～2次后，于0．2%硝酸银溶液中染色10min，水洗3～5次，再于含有0．4%甲醛的1．5%NaOH溶液中显色，最后用0．75%的Na2CO3溶液终止。染色后的凝胶用quantityone软件分析各条带分子量。　　　　2．4 DNA序列测定　　　　挑选apo(a)(TTTTA)串联重复序列数为5、8、9的各2个样品用pGEM－T载体克隆，送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序。　　　　2．5 统计学分析　　　　数据以均数和标准差表示，apo(a)PNＲ等位基因和基因型频率采用基因计数法计算，组间等位基因与基因型频率比较采用χ2检验，组间血脂水平比较采用中位数计算的方法，组内不同基因型血脂水平比较通过方差齐性分析后，采用t检验，使用spss16．0软件包进行统计学分析。　　　　3 结果　　　　3．1 血脂水平比较　　　　CHD组与正常对照组各血脂水平见表1，其中CHD病人血浆TG、Lp(a)水平高于正常对照组，而血浆HDL－C水平低于正常对照组。　　　　3．2 PCＲ扩增　　　　产物的检测apo(a)5'端调控区信号密码子上游1373bp处的(TTTTA)n五核苷酸串联重复序列PCＲ扩增产物经3%琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。　　　　3．3 等位基因与基因型频率分布　　　　两组人群检测出(TTTTA)重复次数为5、7、8、9共4种等位基因，对应PCＲ扩增产物的分子量分别为81bp、91bp、96bp、101bp，其中冠心病病人中检测出重复次数为5、8、9共3种等位基因，两组apo(a)PNＲ等位基因频率见表2。　　　　另外，两组人群检测出5/8、5/9、5/5、7/9、8/8、8/9、9/9共7种基因型，见图2，两组apo(a)PNＲ基因型频率见表3，均无显著性差异。　　　　冠心病病人中apo(a)PNＲ中8/8与8/9基因型的平均血浆Lp(a)分别为204．58±115．15mg/L和170．60±93．84mg/L，通过t检验比对发现无显著性差异，其它几种基因型病例数太少，因此未进行统计分析。　　　　4 讨论　　　　大量研究发现，高Lp(a)血症是动脉粥样硬化的独立危险因子，其与纤溶酶原结构相似，可竞争性的抑制纤溶酶原转化为纤溶酶。另外还发现，血浆Lp(a)水平的升高会促进血栓的形成，而血栓的形成有利于肿瘤细胞附着于血管，加速肿瘤细胞的转移速度，且近年来研究发现，他汀类降血脂药物可以抑制肿瘤细胞增殖。　　　　本研究测定内蒙古地区蒙古族冠心病病人血浆Lp(a)平均水平为201．09±101．04显著性高于正常对照组(P＜0．05)，但低于胡波等测定的湖北地区汉族动脉硬化性脑梗死病人的Lp(a)浓度239．9+225．4mg/L，BoHu等检测的冠心病病人血浆Lp(a)浓度247+225mg/L，及刘晓宁测定的心肌梗死病人血浆Lp(a)的平均水平263mg/L。众所周知，蒙古族人群的饮食习惯是以肉食和奶制品为主，而这些数值的差异，进一步说明血浆Lp(a)浓度具有地区、种族的差异，且几乎不受饮食及生活方式的影响。　　　　本次研究发现，内蒙古地区蒙古族人群共存在4种apo(a)5'端PNＲ等位基因和7种基因型，分别为重复次数5、7、8、9和5/8、5/9、5/5、7/9、8/8、8/9、9/9，明显少于MarionT等人发现的黑种人、欧美白种人、胡波等发现的湖北地区汉族人群及梁红艳等人发现的哈尔滨地区人群的等位基因和基因型的种类，但是序列重复数为8的等位基因及基因型8/8频率均最高。Apo(a)等位基因及基因型的分布与地区、种族的差异有关，而蒙古族是个古老民族，人口迁移率不高，且我们选取的研究对象为3代直系亲属均为蒙古族有关;也可能是因为那些基因型分布频率太低，未能被发现。　　　　本次研究发现冠心病病人血浆Lp(a)浓度明显高于正常对照组，而apo(a)5'端PNＲ各等位基因及基因型频率与正常对照组比较无显著性差距。　　　　目前，已经研究发现血浆Lp(a)水平主要受遗传因素影响，且与apo(a)大小呈反比例关系那么apo(a)的PNＲ究竟起到什么调控作用呢?目前，我们认为其对apo(a)表达的调控是与其它调控位点协调作用的结果，那么，它究竟是与哪些位点共同作用其作用呢，Kringle重复序列，一些单核苷酸多态性位点，还是apoE的基因多态性呢?接下来我们准备利用ＲNAi技术对apo(a)5'端的多态性位点进行干扰，以了解其对apo(a)的大小、表达量和Lp(a)合成的影响。　　　　本次研究共发现了4种等位基因，但是冠心病病人各等位基因及基因型频率与正常对照组比较无显著性差距，这与胡波等及刘晓宁对对汉族冠心病病人研究发现的等位基因(TTTTA)5及基因型(TTTTA)5/8频率明显高于正常对照组有所不同。因此，apo(a)等位基因(TTTTA)5可能是我国汉族人群冠心病发生的一个危险因素，但对于内蒙古地区蒙古族冠心病病人来说apo(a)5'端PNＲ基因多态性与冠心病的发生未发现直接相关性，但是不排除其与其它调控位点协同作用对冠心病的发生发展具有影响。