探讨IL-37对单核巨噬细胞的泡沫化的作用及机制

　　动脉粥样硬化（ＡＳ）是一种累及全身血管的慢 性病变。ＡＳ不仅仅是脂质代谢紊乱，同时也是一种慢性炎症性疾病，多种免疫细胞及细胞因子参与了其发生与进展。单核细胞迁移到内皮下转化为具有吞噬作用的巨噬细胞，通过清道夫受体（ｓｃａｖ－ｅｎｇｅｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＳＲ）吞噬脂质形成泡沫细胞，释放一系列炎性因子及趋化蛋白，启动炎症级联反应，促进ＡＳ进展。此外，泡沫细胞沉积于内皮下，导致内膜进一步改变。白细胞介素（ＩＬ）被认为是调节ＡＳ进展中泡沫细胞形成的关键因素。　　ＩＬ－３７能够抑制多种炎性因子的表达，平衡体内促炎因子与抑炎因子，抑制树突状细胞的活化，减轻炎症 反应。有实验在ＡＳ组织泡沫细胞中检测到ＩＬ－３７蛋白表达，但其能否影响单核巨噬细胞的泡沫化尚未明确。本研究以人单核细胞系ＴＨＰ－１为对象，体外模拟巨噬细胞泡沫化的过程，观察ＩＬ－３７的作用，并对可能机制进行探讨。　　１材料与方法　　１．１材料　　ＴＨＰ－１细胞系购自美国ＡＴＣＣ公 司，ＲＰＭＩ１６４０及胎牛血清购 自Ｇｉｂｉｃ公 司，ｏｘ－ＬＤＬ购 自Ｙｉｙｕａｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司，小鼠抗人ＡＢＣＡ－１单克隆抗体（ｓｃ－５８２１９）购自美国ＳＡＮＴＡ　ＣＲＵＺ公司，β－Ａｃｔｉｎ（ｓｃ－４７７７８）购自美国ＳＡＮＴＡ　ＣＲＵＺ公司，兔抗人ＣＤ３６单克隆抗体购自美国ＥＰＩＴＯＭＩＣＳ公司，小鼠 抗 人ＳＲ－Ａ单克隆抗体购自美国Ｒ＆Ｄ公 司，Ｔｒｉｚｏｌ及ＲＴ－ＰＣＲ试 剂 盒 购 自 日 本Ｔａｋａｒａ公 司，ＣＤ３６引物、ＳＲＡ引物、ＡＢＣＡ－１引物、ＧＡＰＤＨ引物由中国武汉擎科生物公司设计合成。　　１．２方法　　１．２．１　ＴＨＰ－１细胞培养ＴＨＰ－１细胞为悬浮生长细胞，用含１０％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ１６４０培养基，培养基加入青霉素（１００Ｕ／ｍｌ）和链霉素（１００μｇ／ｍｌ），３７℃、５％ ＣＯ２培养箱中静置培养，每２～３ｄ传代１次。　　１．２．２巨噬细胞的分化１　０００×ｇ、５ｍｉｎ离心上述培养的ＴＨＰ－１细胞，弃上清，按１×１０６／ｍｌ重悬于新的培养基中，接种到６孔板或者细胞培养瓶中，加入ＰＭＡ（终浓度为１６０ｎｍｏｌ／Ｌ），３７℃、５％ＣＯ２培养箱中静置培养２４ｈ，观察细胞贴壁和形态改变。　　１．２．３分组及建立泡沫细胞模型ＴＨＰ－１细胞（１×１０６／ｍｌ）在１６０ｎｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＡ刺激２４ｈ分化为巨噬细胞，然后分别给予ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）、ｏｘ－ＬＤＬ（５０ ｍｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－３７（５ｎｇ／ｍｌ）、ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－３７（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－３７（２０ｎｇ／ｍｌ）。各组细胞均置５％ ＣＯ２、３７℃孵箱，培养２４ｈ。其中仅给予ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）单独刺激的对照组再进行进一步分组实验，一组给予ＩＬ－３７（１０ｎｇ／ｍｌ），另一组仅更换新鲜培养基，２４ｈ后收集细胞。　　１．２．４油红Ｏ染色观察泡沫细胞形态将ＴＨＰ－１培养于放有盖玻片的６孔培养板内，用ＰＭＡ刺激２４ｈ后，加入ｏｘ－ＬＤＬ和（或）ＩＬ－３７干预２４ｈ。待处理结束后，弃上清，用预冷ＰＢＳ液冲洗３次。４％多聚甲醛固定２～４ｍｉｎ，０．３％油红Ｏ染色液染色１５～２０ｍｉｎ，苏木素染色５ｍｉｎ，盐酸酒精分色，明胶甘油封片，显微镜观察。收集图像并用图像分析系统分析。　　１．２．５细胞内脂质测定弃干预后的细胞培养液，用预冷ＰＢＳ冲洗３次，冰浴３０ｍｉｎ，用细胞刮刮下细胞，８００×ｇ离心１０ｍｉｎ，加入０．５ｍｌ的氯仿－甲醇（２∶１）混合液研磨，３　０００×ｇ、４℃离心３０ｍｉｎ，取上清液，加两倍体积的冰生理盐水，３　０００×ｇ离心３０ｍｉｎ，去除上层液体，将下层有机相转移到干燥的ＥＰ管，用ＴＣ试 剂 盒 测 定ＴＣ，沉 淀 用０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ　０．２ｍｌ溶解，ＢＣＡ法测细胞内蛋白质含量。细胞内胆固醇含量用每克蛋白所含的ＴＣ表示。　　１．２．６　ＲＴ－ＰＣＲ检测ＲＮＡ提取上述干预后的细胞，用预冷ＰＢＳ冲洗３次，每孔加入１ｍｌ　Ｔｒｉｚｏｌ，静置１０ ｍｉｎ，用枪吹打 数次，吸入无ＲＮＡ酶 的１．５ｍｌ　ＥＰ管中，每管加入２００μｌ氯仿，震荡数秒，室温静置１０ｍｉｎ，１２　０００×ｇ、１５ｍｉｎ，４℃，离心；吸取上层液体层２００～３００μｌ到另一ＥＰ管中，等体积加入预冷的异丙醇，轻轻混匀，－２０℃，放置１０ｍｉｎ，１２　０００×ｇ、１５ｍｉｎ，４℃离心；弃上清，加入１ｍｌ预冷无水乙醇，７　５００×ｇ、１０ｍｉｎ，４℃，离心；尽最大可能将上清丢弃，加入２０μｌ的ＤＥＰＣＨ２Ｏ。　　ＲＮＡ浓度和纯度测定取１μｌ所提取的ＤＮＡ溶液加入９９μｌ　ＤＥＰＣ水，充分混匀，然后用核酸分析仪检测Ａ２６０，Ａ２６０／Ａ２８０比值，ＲＮＡ浓度（ｍｇ／ｍｌ）＝Ａ２６０×１００×稀释倍数，Ａ２６０／Ａ２８０比值在１．８～２．０纯度较高。逆转录温度梯度ＰＣＲ仪按３７℃１５ｍｉｎ、８５℃５ｓ、４℃的程序进行逆转录。　　ＰＣＲ引物序列 引 物 序 列 如 下：　　ＧＡＰＤＨ：５′－ＣＣＡＣＣＣＡＴＧ－ＧＣＡＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡ －３′，５′－ＴＣＴＡＧＡＣＣＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣ－３′；ＣＤ３６：５′－ＧＡＧＡＡＣＴＧＴＴＡＴ－ＧＧＧＧＣＴＡＴ－３′，５′－ＴＴＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＧＧＣＡＡＡＧ－Ｇ－３′；ＳＲ－Ａ：５′－ＣＣＡＧＧＧＡＣＡＴＧＧＡＡＴＧＣＡＡ－３′，５′－ＣＣＡＧＴＧＧＧＡＣＣＴＣＧＡＴＣＴＣＣ－３′；ＡＢＣＡ１：５′－ＴＧＴ－ＣＣＡＧＴＣＣＡＧＴＡＡＴＧＧＴＴＣＴＧ －Ｔ３′，５′－ＡＡＧＣＧＡ－ＧＡＴＡＴＧＧＴＣＣＧＧＡＴＴ －３′。　　ＲＴ－ＰＣＲ按Ｔａｋａｒａ公司ＰＣＲ试剂盒说明，按ＲＯＸ　０．２μｌ，ＳＹＢＲ?Ｐｒｅｍｉｘ　ＥｘＴａｑＴＭ　ＩＩ　５μｌ，ＰＣＲ　Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　０．２μｌ，ＰＣＲ　Ｒｅ－ｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　０．２μｌ，ＤＮＡ模板１μｌ，ｄＨ２Ｏ　３．４μｌ，配制１０μｌ扩增体系；采取两步法ＰＣＲ扩增标准程序：９５℃、３０ｓ，９５℃、５ｓ，６０℃退火、延伸３０ｓ，共４０个循环。　　１．２．７　Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测蛋白质提取上述干预后的细胞，预冷ＰＢＳ冲洗３次，细胞刮用力将细胞刮落，用１ｍｌ　ＰＢＳ重悬于１．５ｍｌ　ＥＰ管中，３　０００×ｇ、１０ｍｉｎ，４℃离心，弃上清，加入现配的与沉淀体积约等的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂复合物，将沉淀吹散，冰浴３０ｍｉｎ，３０ｓ、６次涡旋，间隔５ｍｉｎ进行１次；１２　０００×ｇ、１０ｍｉｎ，４℃，离心；吸取上清为细胞蛋白质。蛋白浓度测定和变性按照ＢＣＡ蛋白测定试剂盒的说明，用酶标仪检测样本的蛋白浓度。而后按每个样本上样６０μｇ分装样本到２００μｌ的ＥＰ管中，９５℃、１０ ｍｉｎ，使蛋白变性。　　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ电泳按浓缩胶６０～８０Ｖ恒压，分离胶１００～１５０Ｖ恒压，到蛋白Ｍａｒｋｅｒ条带区分明显或者溴酚蓝到达分离胶最低端；转膜用３００ｍＡ恒流，根据目标蛋白分子量大小决定转膜时间；５％脱脂奶粉封闭３ｈ，ＴＢＳＴ洗涤５ｍｉｎ、３次，一抗按说明书要求稀释，摇床冰浴过夜；ＴＢＳＴ洗涤５ｍｉｎ、３次，二抗按１∶３　０００稀释，封闭２ｈ；ＴＢＳＴ洗涤５ｍｉｎ、３次，用Ｉｍａｇｅ　Ｌａｂ成像系统检测并收集图像。　　１．３统计学处理　　实验均重复３次，实验数据以珚ｘ±ｓ表示，采用ＳＰＳＳ１２．０作统计学处理。组间数据处理根据方差齐性分析的结果，进一步使用ＳＮＫ检验，进行组间差异的比较，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。　　２结果　　２．１泡沫细胞形态及细胞内脂质测定光固定和油红Ｏ染色光镜下显示，ＩＬ－３７＋ｏｘ－ＬＤＬ组细胞摄取ｏｘ－ＬＤＬ减少，胞内脂质小滴显着减少，油红Ｏ染色阳性细胞较ｏｘ－ＬＤＬ组显着减少，且细胞形态多改变较 少 （图１）。ＩＬ－３７＋ｏｘ－ＬＤＬ组巨噬细胞内ＴＣ水平较ｏｘ－ＬＤＬ组显着减少［（１５０．４±７．３６）ｎｇ／ｍｇ∶（３０３．１±８．９）ｎｇ／ｍｇ，Ｐ＜０．０１］。　　　　２．２　ＴＨＰ－１源巨噬细胞ＣＤ３６、ＳＲＡ及ＡＢＣＡ－１的表达水平Ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）组和ＩＬ－３７（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）组ＴＨＰ－１源巨噬细胞ＣＤ３６、ＳＲＡ及ＡＢＣＡ－１蛋白及ｍＲＮＡ表达水平见表１，不同浓度ｏｘ－ＬＤＬ组表达水平见表２。　　　　２．３泡沫细胞ＣＤ３６、ＳＲＡ及ＡＢＣＡ－１的表达水平Ｏｘ－ＬＤＬ（５０ｍｇ／ｍｌ）组和ＩＬ－３７（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ｏｘ－ＬＤＬ（５０ ｍｇ／ｍｌ）组 泡 沫 细 胞ＣＤ３６、ＳＲＡ及ＡＢＣＡ－１蛋白及ｍＲＮＡ表达水平见表３。　　３讨论　　ＡＳ是是一种多因素参与的病理过程。脂质代谢紊乱和炎症反应是致ＡＳ的最主要的两个原因，彼此相互促进，加速ＡＳ的进展。血液中的单核细胞迁移进入内皮下分化为巨噬细胞，通过ＳＲ吞噬血管内膜下聚集的脂质尤其是ｏｘ－ＬＤＬ形成泡沫膜细胞，启动ＡＳ的进程。泡沫细胞聚集形成斑块是ＡＳ的主要病变特征，同时泡沫细胞的形成启动了动脉内皮下慢性炎症级联反应，促进病变的进展。　　研究表明，多种细胞因子在ＡＳ泡沫细胞的形成中发挥了重要作用。这些细胞因子可以通过上调或下调巨噬细胞表面ＳＲ，调节巨噬细胞对脂质的摄取，促进或者抑制泡沫细胞的形成；也可以通过上调或下调巨噬细胞逆向脂质运输相关蛋白的表达，延缓或加速泡沫细胞的形成。巨噬细胞通过细胞表面表达的一系列ＳＲ识别、摄取内皮下脂质；同时也表达逆向胆固醇转运蛋白，处理胞内聚集的脂质；二者的失衡将影响泡沫细胞的形成。　　本实验表明，ＩＬ－３７能够抑制ＴＨＰ－１源巨噬细胞摄取ｏｘ－ＬＤＬ，促进胞内脂质外流，减少泡沫细胞的形成，具有抗ＡＳ的作用。我们通过油红Ｏ染色从形态学观察到ＩＬ－３７能够减少ＴＨＰ－１源巨噬细胞形成泡沫细胞，降低ＴＨＰ－１源巨噬细胞胞内ＴＣ的聚集。与ＩＬ－１０通过多种机制减少泡沫细胞的形成，其中有些存在争议。本实验明确了ＩＬ－３７抑制泡沫细胞的机制，与ＩＬ－３３、ＴＧＦ－β相似，ＩＬ－３７通过抑制ＳＲＡ和ＣＤ３６，同时增强逆向胆固醇运输蛋白ＡＢＣＡ１的表达，减轻巨噬细胞脂质负荷，减少泡沫细胞的形成，且该作用具有浓度依赖性。此外，用ＩＬ－３７和ＰＭＡ同时刺激ＴＨＰ－１的分化，能够减少巨噬细胞的形成，并且抑制所活化的巨噬细胞形态的改变，如变形、伸出伪足的细胞明显减少，与之前的研究一致。　　研究表明，ＩＬ－３７具有下调多种炎性因子的作用，减少体内树突状细胞的数量，且可以下调树突状细胞表面蛋白ＣＤ８６和ＭＨＣⅡ表达量，减轻固有免疫和适应性炎症反应。与ＩＬ－３３和ＩＬ－１α相似，ＩＬ－３７具有双重生物学活性，一方面作为可溶性细胞因子，通过与ＩＬ－１８α或者ＩＬ－１８ＢＰ结合，发挥抗炎作用，但是详细的机制尚未阐明；另一方面成熟的ＩＬ－３７作为核转录因子进入细胞核，与Ｓｍａｄ３相互作用，调节多条信号通路的关键酶，包括ＦＡＫ、ＰｙＫ２、ＭＡＰＫｐ３８、ＳＴＡＴｓ１－４等。转染ＩＬ－３７的ＴＨＰ－１细胞，受到ＬＰＳ和ＩＦＮ－γ刺激后，与对 照 组 相 比，ＦＡＫ、Ｐｙｋ２、ＭＡＰ　ｋｉｎａｓｅ　ｐ３８α、ＳＴＡＴｓ、ｐ５３、ＴＯＲ的表达显着下调［１］；其中ＳＴＡＴ是脂质代谢ＪＡＫ／ＳＴＡＴ信号通路的关键转录因子，通过调控ＡＢＣＡ１的表达影响吞噬细胞逆向转运胞内脂质；此外，ｍＴＯＲ信号通路、ＭＡＰＫ信号通路也参与了巨噬细胞的脂质代谢。所以，我们推测成熟的ＩＬ－３７进入细胞核后，与Ｓｍａｄ３结合，通过多条脂质代谢通路调节巨噬细胞ＳＲ和胆固醇逆向转运受体的表达，调控巨噬细胞泡沫化，从而影响ＡＳ的进程。　　ＳＲ和逆向胆固醇转运蛋白是巨噬细胞泡沫化的关键因素，ＳＲＡ和ＣＤ３６是巨噬细胞结合和摄取ｏｘ－ＬＤＬ的主要受体，ＡＢＣＡ１是巨噬细胞内胆固醇外流的重要转运体。敲除ＣＤ３６基因后小鼠以及同时敲除ＣＤ３６，ＳＲＡ基因小鼠ＡＳ进程明显延缓；而上 调ＡＢＣＡ１则 能 够 延 缓ＡＳ的 进 展，表 明ＣＤ３６、ＳＲＡ和ＡＢＣＡ１起着重要的作用。本实验结果表明，ＩＬ－３７可以显着抑制ＣＤ３６和ＳＲＡ的表达，促进ＡＢＣＡ－１的表达，且有剂量依赖关系。此外，对 已 形 成 的 泡 沫 细 胞，ＩＬ－３７也 能 显 着 上 调ＡＢＣＡ１，下调ＳＲＡ和ＣＤ３６的表达。　　综上所述，ＩＬ－３７具有抗ＡＳ的作用。结合之前关于ＩＬ－３７具有下调多种炎性因子、抑制炎性细胞活化、减轻炎症反应的研究，相信ＩＬ－３７有可能会成为ＡＳ预防和治疗的新靶点。　　参考文献　　［１］ＮｏＬＤ　Ｍ　Ｆ，ＮＯＬＤ－ＰＥＴＲＹ　Ｃ　Ａ，ＺＥＰＰ　Ｊ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．ＩＬ－３７ｉｓ　ａ　ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｉｎｎａｔｅ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１０，１１：１０１４－１０２２．　　［２］ＭＣＮＡＭＥＥ　Ｅ　Ｎ，ＭＡＳＴＥＲＳＯＮ　Ｊ　Ｃ，ＪＥＤＬＩＣＫＡ　Ｐ，ｅｔａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　３７ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｃｔｓ　ｍｉｃｅ　ｆｒｏｍ　ｃｏｌｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ，２０１１，１０８：１６７１１－１６７１６．　　［３］ＢＯＲＡＳＣＨＩ　Ｄ，ＬＵＣＣＨＥＳＩ　Ｄ，ＨＡＩＮＺＬ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．ＩＬ－３７：ａ　ｎｅｗ　ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＩＬ－１ｆａｍｉｌｙ［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｎｅｔｗ，２０１１，２２：１２７－１２４７．　　［４］ＭＣＬＡＲＥＮ　Ｊ　Ｅ，ＭＩＣＨＡＥＬ　Ｄ　Ｒ，ＳＡＬＴＥＲ　Ｒ　Ｃ，ｅｔａｌ．ＩＬ－３３ｒｅｄｕｃｅｓ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｆｏａｍ　ｃｅｌｌ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１０，１８５：１２２２－１２２９．　　［５］ＳＡＫＡＩ　Ｎ，ＶＡＮ　ＳＷＥＲＩＮＧＥＮ　Ｈ　Ｌ，ＢＥＬＩＺＡＩＲＥ　ＲＭ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３７ｒｅｄｕｃｅｓ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｉｎｊｕｒｙ　ｖｉａ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　ｎｏｎ－ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ　ＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏＨｅｐａｔｏｌ，２０１２，２７：１６０９－１６１６．　　［６］ＹＵ　Ｍ，ＫＡＮＧ　Ｘ，ＸＵＥ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　４ｉｓ　ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｍＴＯＲ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ＴＨＰ－１ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｆｏａｍ　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｃｔａ　ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓ　Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ），２０１１，４３：９４０－９４７．　　［７］ＭＯＯＲＥ　Ｋ　Ｊ，ＴＡＢＡＳ　Ｉ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏ－ｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２０１１，１４５：３４１－３５５．