糖尿病视网膜病变 ( diabetic retinopathy，DＲ) 目前是主要的致盲原因之一［1］，也是糖尿病最为常见和严重的微血管并发症之一。糖尿病视网膜病变基本的病理改变为毛细血管内皮细胞增生、基底膜增厚、内皮细胞损伤、通透性增加、新生血管形成和纤维组织化［2］。基底膜为细胞外基质的存在方式之一，层粘连蛋白( LN) 和纤维粘连蛋白( FN) 是细胞外基质( ECM)的主要成分，其主要功能是介导细胞间的黏附、增殖、迁移及分化等过程［3］。本实验应用 KK/Upj-Ay 自发性 2 型糖尿病小鼠模型，观察通心络胶囊对糖尿病视网膜组织 LN、FN 表达的影响，进一步探讨糖尿病视网膜病变的发病机制。
1 材料与方法
1． 1 实验动物 SPF 清洁级 KK / Upj-Ay 糖尿病小鼠40 只，体重 30 ～ 40 g; SPF 清洁级 C57BL /6 小鼠，体重25 ～ 30 g，均为雄性，12 周龄，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号: SCXK-( 京) 2009-0002。
1． 2 药品与试剂 通心络胶囊购于石家庄以岭药业股份有限公司，层粘连蛋白( FN) 、纤维粘连蛋白( LN) 抗体均购于 abcam 公司。
1． 3 实验分组与给药 KK / Upj-Ay 小鼠按空腹血糖值( FBG) 随机分为模型组、通心络高剂量组、通心络中剂量组、通心络低剂量组，对照组使用 C57BL/6 小鼠，每组均为 10 只。通心络高、中、低剂量组分别给予生药量 4、2、1 g/kg 的通心络胶囊，对照组和模型组分别给予等体积的蒸馏水，每组均采用灌胃途径给药，1 次 / d，连续给药 3 个月。
1． 4 Ｒeal Time PCＲ( qPCＲ) 方法测定 FN、LN mＲNA的表达 取小鼠眼球，仔细分离视网膜组织，常规方法提取 ＲNA，进行 qPCＲ 扩增，以 GAPDH 作为内参照。GAPDH 引物: 上游 5 '-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3‘，下游 5'-TGCTGAGTATGTCG TGGAGTC-3’，产物片段143 bp; FN 引物: 上游 5 '-GGAGAACCAGGAGAGCA-CAC-3 ‘，下游 5 '-CACAAACTGTAGGTCCGTCG-3 ’，产物片段 97 bp; LN 引物: 上游 5'-AAGGGCTTTGGGATGT-CAT-3‘，下游 5 '-CGAGTCCAGTTCAGCGTGA-3 ’，产物片段88 bp; 实验结果与对照组进行比较后的相对值记为最终结果，对照组设置为 1。
1． 5 Western blot 法检测 FN、LN 蛋白的表达 取视网膜组织，低温储存，常规方法提取蛋白质，化学发光法显色，对条带进行吸光度积分扫描。GAPDH 作为内参照。用目的蛋白吸光度值/内参照吸光度值的比值进行比较。
1． 6 统计学分析 应用 SPSS 17． 0 统计软件，计量资料以 x珋 ± s 表示，采用单因素方差分析，两两比较应用S-N-K 法，P ＜ 0． 05 为差异具有统计学意义。
2 结果
2． 1 视网膜 FN、LN mＲNA 表达变化 与对照组比较，模型组小鼠视网膜组织 LN mＲNA 表达明显增高( P ＜0． 05) ; 通心络低、中、高各剂量组 LN mＲNA 表达水平均较模型组明显下降( P ＜0． 05) ，随着剂量的增加 LN 的表达逐渐下降，各组之间互相比较差异均具有显着性( P ＜0． 05) 。与对照组相比，模型组小鼠视网膜组织 FN mＲNA 表达明显升高( P ＜ 0． 05) ; 而低、中、高剂量组 FN mＲNA 表达水平均较模型组明显降低( P ＜0． 05) ，而高剂量组较中、低剂量组的表达下调更为明显( P ＜0． 05) 。见表 1。【1】
2． 2 视网膜 FN、LN 蛋白的表达变化 Western blot结果显示模型组小鼠视网膜 FN、LN 蛋白表达均明显高于对照组( P ＜ 0． 05) ; 与模型组比较，通心络各剂量组 FN、LN 蛋白表达均显着下降( P ＜0． 05) 。见表2，图 1。【2】
3 讨论
DＲ 是一种世界性的致盲眼病，是糖尿病患者的主要并发症之一，高血糖是 DＲ 视网膜损伤的重要始发因素［4］。持续性的高血糖状态可以诱发包括蛋白激酶 C 激活、氧化应激、氨基己糖通路活性增高等一系列代谢异常，诱发一系列复杂的级联反应造成视网膜循环障碍［5］，使周围毛细血管内皮细胞失去调节能力，毛细血管内皮细胞的基底膜增厚，进而造成毛细血管的阻塞引起周围组织缺血水肿，伴微血栓形成甚至血管闭塞［6］。视网膜微血管闭塞性改变，属中医“络病”范畴，临床用药清除瘀血，通其血脉，偏重治络，药物选择应在整体辨证的基础上，加上辛味药和虫类药的应用，以达到扶正及祛邪通络的目的［7］。通心络是一种由人参、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鳖虫、蝉蜕、赤芍等组成的中药复方制剂; 有研究表明，其可改善糖尿病患者视网膜微循环，减轻视网膜及黄斑水肿，疗效确切［8］。随着对细胞外基质( ECM) 的分子结构和功能的研究，发现 ECM 在 DＲ 发生中具有重要的作用，已引起中外学者的关注［9］。FN、LN 是 ECM 大家族中的重要成员，是构成基底膜的主要成分，FN 可以与细胞外基质各类成分相结合，并促进细胞外基质其他成分的沉积; LN 则可以引起细胞黏附并影响基底膜的电荷选择性，导致毛细血管通透性改变，加重视网膜损伤［10］。
因此，FN、LN 作为细胞与间质相互作用的桥梁，在 DＲ的发生发展中起着重要作用。
本实验观察通络药物通心络胶囊对自发性 2 型糖尿病小鼠( KK/Upj-Ay 小鼠) 视网膜病变的影响。结果显示模型组小鼠视网膜组织 FN、LN 的表达与对照组比较显着升高( P ＜ 0． 05) ，给予通心络灌胃治疗后，通心络高、中、低剂量组小鼠视网膜组织 FN、LN 的表达明显减少( P ＜0． 05) ，提示通心络胶囊可通过抑制糖尿病小鼠视网膜组织 FN、LN 的合成，缓解糖尿病视网膜病变，为中医治疗 DＲ 提供了理论依据。 参考文献 1 王蕾蕾，王宁，冯奕斌，等． 中医药治疗糖尿病视网膜病变临床与基础研究进展． 中国中医眼科杂志，2014，24: 227-232． 2 Scanlon Peter H． Diabetic retinopathy． Medicine，2010，38: 656-660． 3 潘琳，李光伟，周水平，等． 细胞外基质纤维连接蛋白和层粘连蛋白在糖尿病大鼠视网膜微血管病变表达的研究． 中华糖尿病杂志，2004，12: 56-59． 4 Choudhuri S，Dutta D，Sen A，et al． Ｒole of N-? -carboxy methyl lysine，advanced glycation end products and reactive oxygen species for thedevelopment of nonproliferative and proliferative retinopathy in type 2 di-abetes mellitus． Mol Vis，2013，19: 100-113． 5 陈霞琳，汪迎，张凯，等． 糖尿病性视网膜病变相关危险因素分析． 临床眼科杂志，2013，21: 320-322． 6 赵凌军． 中西医结合治疗糖尿病视网膜病变的临床效果分析． 中国实用医药，2014，9: 165-166． 7 郭承伟，张宏国，马栋． 从络论治糖尿病视网膜病变的理论与应用探讨． 中国中医眼科杂志，2011，21: 255-257． 8 孟宪民，张书申，段永畅． 通心络胶囊联合激光治疗糖尿病性视网膜病变的观察． 医药论坛杂志，2011，32: 155-156． 9 Kowluru ＲA，Tang J，Kern TS． Abnormalities of retinal metabolism in dia-betes and experimental galactosemia． VII． Effect of long-term administra-tion of antioxidants on the development of retinopathy． Diabetes，2001，50: 1938-1942． 10 苑维，金明，潘琳，等． 红参对糖尿病大鼠视网膜微血管病变细胞外基质的影响． 中国中医眼科杂志，2004，14: 200-203．