美金刚是一种非竞争性 N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂,它可以阻断谷氨酸浓度病理性升高导致的神经元损伤[1],临床上主要用于治疗中重度至重度阿尔茨海默型痴呆,可以减少临床症状的恶化,改善患者的生活质量[2,3].目前以液相色谱质谱联用方法检测人血浆中美金刚浓度的文献报道[4]并不多,本研究对美金刚的血浆浓度检测方法进行了改进,并且按照指导原则的要求对方法学进行了全面确证,成功应用于美金刚的生物等效性研究.
1 材 料
1.1 试验药物与仪器:盐酸美金刚对照品(批号:A0282413,含量 99.9%,上海悍马化学科技有限公司提供),内标物金刚烷胺(批号:10156550,含量 99.0%,Alfa Aesar A Johndon MattheyCompany).Agilent 1200 高效液相色谱仪(美国 Agilent);Agi-lent 6410 triple quad LC/MS.
2 方法与结果
2.1 色谱质谱条件:色谱柱:Agilent Eclipse plus C18(4.6mm×150mm,3.5μm);流动相:甲醇∶水=95∶5(V∶V,含 0.005mol·L-1甲酸铵和 0.1%甲酸);流速:0.5ml·min-1;柱温:40℃.电喷雾电离源(ESI),毛细管电压 4000V,喷雾气压力 50PSI,干燥气体流速 10L·min-1,干燥气体温度 350℃.选择性离子监测,美金刚 m/z 180→163,裂解电压 100V;金刚烷胺 m/z 152→135,裂解电压 105V.
2.2 标准溶液的配制:配制成浓度为 1g·L-1的美金刚和金刚烷胺贮备液,试验前按需稀释成相应浓度的标准工作液,将适量标准液加入空白血浆配置成低中高质控品,浓度分别为 5μg·L-1、50μg·L-1、200μg·L-1.另稀释配置浓度为 50μg·L-1的内标金刚烷胺流动相溶液.
2.3 样品处理方法:取含药血浆 0.5ml,加入内标溶液 50μL,加0.2mol·L-1氢氧化钠水溶液 0.1ml,再加醋酸乙酯∶二氯甲烷=4∶1 混合提取剂 3ml,旋涡振荡 1min,离心 10min,吸取有机层42℃真空干燥至干.进样前加入流动相混合溶液 200μl 使残渣溶解,离心吸取上清液 3μl 进样.
2.4 方法学验证2.4.1 方法专属性:美金刚、金刚烷胺的出峰时间约为 2.9min及 2.8min.
2.4.2 标准曲线的制备和定量下限:经分析,血浆中美金刚浓度在 0.2~30μg·L-1范围内呈良好的线性关系,典型代表方程为:y=0.6186×x+4.2615×10-4,r2=0.9982 (n=7,1/X2).定量下限为0.2μg·L-1(S/N>10),其方法回收率平均为 95.26%,RSD 为5.15%(n=5).
2.4.3 介质效应考察:低、中、高浓度的美金刚质控和内标金刚烷胺(50μg·L-1) 的介质影响百分比分别为 90.80%、92.87%、91.26%和 90.97%(n=3),美金刚低、中、高浓度介质效应对质量测定影响程度基本一致.
2.4.4 精密度与准确度及提取回收率试验:配制低、中和高浓度的美金刚血浆溶液各 15 份,分为 3 批,每批 5 份,并与每批的标准曲线同时进行,结果表明批内批间 RSD 在 1.03%~13.90%之间,准确性在 95.2%~99.9%之间.实验结果表明美金刚低、中和高浓度质控和内标的提取回收率分别为 79.08%、82.25%、82.82%和 81.24%.
2.4.5 稳定性试验:配制低、中和高浓度的美金刚血浆质控样品,分别考察了质控经过萃取后流动相复溶室温放置 24h,室温放置 1h 和 24h,冻融 1 次、3 次,-20℃冻存 1d、7d 和 25d 的稳定性.低、中、高 3 个浓度样品在各种条件下的检测结果的准确度在 85%~115%之间,RSD 均小于 15%.
2.4.6 生物等效性评价:本试验方案经广州市脑科医院药物临床试验伦理委员会批准,20 名健康男性受试者采用两制剂双周期交叉方案给药,清洗期为 4 周.试验日早晨空腹给药10mg 美金刚,于服药前(0h)和服药后 1、2、3、4、5、6、8、12、24、48、96、144,192h 取前臂静脉血 4ml,离心分离血浆保存待测.用上述方法检测获取的标本,用 DAS3.0 软件进行生物等效性评价,经过统计分析,两种制剂生物等效.
3 讨 论
目前已有一些文献报道使用 LC-MS/MS 方法检测血浆中美金刚浓度,但是有些方法取样量过大,有些缺乏介质效应考察.本研究经过方法学优化后取样量降至 0.5ml,灵敏度没有降低.介质效应是指除分析物以外的其他成分对分析物测定值的影响,是以软电离为基础的质谱法(例如 LC-MS、LC-MS/MS)重要的考察指标之一.本研究结果表明低、中和高浓度的美金刚质控和内标金刚烷胺的介质效应不存在浓度依赖性.
参考文献.
[1]Limapichat W,Yu WY,Branigan E,Lester HA,DoughertyDA. Key binding interactions for memantine in the NMDA recep-tor[J]. ACS Chem Neurosci. 2013 Feb 20,4(2):255-260.
[2]Brem AK,Atkinson NJ,Seligson EE,Pascual-Leone A. Dif-ferential Pharmacological Effects on Brain Reactivity and Plastici-ty in Alzheimer's Disease[J]. Front Psychiatry. 2013 Oct 7,4:124.
[3]Wilkinson D,Wirth Y,Goebel C. Memantine in Patients withModerate to Severe Alzheimer's Disease:Meta -Analyses UsingRealistic Definitions of Response[J].Dement Geriatr Cogn Disord.2013 Oct 3,37(1-2):71-85.
[4]李雪晴,刘文星,贾艳艳,等.两种盐酸美金刚片的人体生物等效性研究[J].中国药房,2012,23(22):2047-2050