板蓝根为常用中药材,为十字花科菘蓝属植物菘蓝(Isatisindigotica Fort)的干燥根,性寒味苦,具有清热解毒、凉血利咽之效,临床上广泛用于抗菌、抗病毒,增强机体免疫力,是清热解毒类重要的代表药物,表告依春为板蓝根抗病毒的代表性成分之一[1-2].2010 版《中国药典》采用高效液相色谱法测定板蓝根中 R,S-表告依春的含量对其进行质量控制,但板蓝根制剂均以氨基酸定性鉴别进行质量控制[3],无专属性指标成分用于质量标准研究,而表告依春为板蓝根抗病毒的代表性成分之一,可以作为指标成分用于质量标准研究.按 GMP 要求,建立板蓝根颗粒的清洁验证方案,考察设备清洁后淋洗水样中表告依春的残留量是否符合限度[4],经过查阅大量文献,做关于板蓝根颗粒清洁验证的实验.
1 仪器与试药
高效液相色谱仪:日本岛津(LC-2010AHT);超声波清洗器;无锡兴邦基业电子(KUDOS);电子分析天平:德国赛多利斯(CPA225D 十万分之一);电子分析天平:德国赛多利斯(BSA224S 万分之一);V 型混合机:扬州诺亚机械(V-5);真空上料机:天津云飞机械(ZKS-5);R,S-表告依春:中国食品药品检定所(201304);甲醇:霍尼韦尔贸易有限公司(20130704);磷酸:天津市百世化工有限公司(20120506);纯化水:新疆华世丹药业有限公司.
2 板蓝根颗粒残留量限度的计算
项目选择 V 型混合机与真空上料机为清洁验证设备,擦拭法取样困难,故选用冲淋水取样,冲淋水取样设备清洗验证可接受标准[4]:每毫升冲洗水(溶剂)中的最大允许残留量为:
LAD/40=NOEL(无显着影响值)=最小有效剂量/40(40 为总体安全系数),50%为取样有效性.
固体口服制剂车间普通生产线的 V 型混合机与真空上料机主要生产氨酚伪麻那敏泡腾颗粒和板蓝根颗粒,为多个活性成分共同接触的共用设备.清洁剂选择的是成分简单效果确切的 2%碳酸氢钠溶液、水、纯化水.板蓝根颗粒最大日用剂量为40g,最小有效剂量为 10g,产品氨酚伪麻那敏泡腾颗粒最小批量 300kg,冲淋水体积 50000ml.按上式计算,板蓝根颗粒残留量限度=0.01875g/ml.
3 方法与结果
3.1 色谱条件:色谱柱为 C18柱;流动相为甲醇:0.02%磷酸水溶液(7∶93);检测波长为 245nm;0.8ml/min;柱温 30℃;进样量10μL.理论板数按 R,S-表告依春峰计应不得低于 5000[5-6].
3.2 对照品贮存液的制备:精密称取 R,S-表告依春 9.75mg,置25ml 量瓶中,加水稀释至刻度.
3.3 对照品溶液的制备:精密移取表告依春对照品贮存液 5ml,置 50ml 量瓶中,加水稀释至刻度.
3.4 供试品溶液的制备:取冲淋结束时的水样过滤两遍.
3.5 样品溶液的制备:取板蓝根颗粒剂 6 袋,每袋精密量取 2.0g,置于 25ml 量瓶中,加水定容,超声提取 30min,冷却,加水补足,滤过.精密量取续滤液 10ml,挥干,残渣用流动相溶解,转移至10ml 量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,过滤即得.
3.6 系统适用性试验:分别取对照品溶液和样品溶液各 10μL,注入高效液相色谱仪,记录色谱图,见图 1,图 2:
4 板蓝根颗粒中表告依春含量测定方法的建立
4.1 线性关系考察:精密量取表告依春对照品溶液 1ml 4 份,分别加入 50、25、10、5ml 量瓶中及 2ml、2.5ml 分别加入 5ml 量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀制成不同浓度的对照品溶液.进行测定,记录色谱图.以峰面积为纵坐标、表告依春的质量浓度为横坐标,绘制标准曲线,见图 3、图 4:线性范围:3.9~95μg/ml,标准曲线:A=85322C-72006,r=0.9995.
4.2 精密度试验:精密量取对照品溶液 10μL,连续进样 5 次,测定峰面积,计算 RSD%,见表 1:
4.3 重复性试验:精密量取样品溶液 10uL,连续进样 5 次,测定R,S-表告依春的含量,计算 RSD%,见表 2:
4.4 加样回收率实验:在已知含量的表告依春溶液中,分别加入一定量的表告依春对照品,按上述色谱条件进样,读取峰面积,测定表告依春的含量,结果见表 3:
4.5 样品测定:取三批样品,按照样品溶液的制备方法制备样品溶液.精密吸取样品溶液 10uL 进样,计算表告依春的含量,结果见表 4:
5 表告依春的残留量限度的确定
经多次试验,计算后,板蓝根颗粒中表告依春的含量不得低于 3.5μg/ml,由板蓝根颗粒残留量限度可得表告依春的残留量限度为 0.0656μg /ml.
6 表告依春的残留量的测定在上述色谱条件下,重新配制不同浓度的对照品溶液(0.04、0.08、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00μg/ml),进样 10μL,记录色谱图.精密度、重现性均良好.以峰面积为纵坐标,表告依春的浓度为横坐标、绘制标准曲线,见图 5、图 6:线性范围 0.04~1.0μg/ml:标准曲线:A=90115C-1320.4,r=0.9997.同时按"4.2"、"4.3""、4.4"项下的条件、方法,进行精密度、重现性、回收率试验考察,RSD 均小于 2%.
7 残留量的测定
7.1 淋洗水取样:按照 SOP/SCQ-G-036-2012、SOP/SCQ-G-087-2012(V 型混合机清洁、真空上料机、消毒规程)收集清洁程序最后一步淋洗即将结束时的水样.
7.2 取样测定:淋洗法样品可对冲洗液直接检测,精密吸取样品溶液 10μL 进样,读取峰面积,计算表告依春的含量,结果见表 5:
8 结 果
板蓝根颗粒中表告依春的含量不小于 3.5μg/ml,清洁验证中最后淋洗水样表告依春的残留量限度为 0.0656μg/ml,V 型混合机冲洗液、真空上料机冲洗液中表告依春的残留量均符合清洁验证的要求.
9 讨 论
9.1 在板蓝根颗粒生产线中,有自动充填包装机、真空上料机、三元旋振筛、快速搅拌制粒机、V 型混合机、摇摆颗粒机等,其中真空上料机和 V 型混合机不能打开清洁,不能直接观察到清洁表面,为较难清洁设备.
9.2 由于现行药典及企业都未确定板蓝根颗粒中表告依春的含量标准,板蓝根制剂均以氨基酸定性鉴别进行质量控制,无专属性定量指标用于产品质量控制.表告依春为板蓝根抗病毒的代表性成分之一,本试验先建立板蓝根颗粒中表告依春的 HPLC含量测定方法,为完善板蓝根颗粒的质量标准提供了实验数据,对保障其质量具有重要意义.
9.3 经过多次试验发现,表告依春的残留量很低,无法采用板蓝根颗粒中表告依春含量测定方法中的线性回归曲线,作为残留量限度的定量检测,重新建立了表告依春残留量的检测方法.
9.4 由于选择的验证设备不能打开清洁,无法用擦拭法取样,故选用冲淋水取样法.最终按 GMP 要求,建立了板蓝根颗粒的清洁验证方案,考察设备清洁后淋洗水样中表告依春的残留量是否符合限度要求.
参考文献
[1]徐丽华,黄芳,陈婷.板蓝根中的抗病毒活性成分[J].中国天然药物,2005,3(6):359.
[2]聂黎行,王刚力,戴忠,等.手型高效液相色谱法测定板蓝根中表告依春含量[J].色谱,2010,28(10):1001-1004.
[3]2010 版《中国药典》一部[S].中国医药科技出版社,2010:191.
[4]冯天炯.中药制剂设备清洗允许残留量及验证方案讨论[J].中成药,2003,25(11):933-934.
[5]石燕红,谢志勇,吴迎春,等.RP-HPLC 测定板蓝根制剂中 R,S-表告依春[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(8).
[6]崔田,张祖亮.高效液相色谱法测定板蓝根颗粒中表告依春含量[J].中国药业,2012,21(8)