钼(Mo)是植物必需的矿质营养元素,作为硝酸还原酶的成分参与到植物体内氮的代谢过程,可以增强植物的光合作用,促进植物体的呼吸代谢作用及繁殖器官的发育。Mo可以称作蔬菜的品质元素,施Mo可以提高蔬菜Vc含量、可溶性蛋白含量。
同时,Mo还是逆境防御元素,可以增强作物对多种逆境的防御能力,例如施Mo能提高冬小麦的抗寒力、增强大麦对水分胁迫的防御能力以及缓解钨对莴苣的毒害作用。从中国盐渍化土壤分布图可以看出,中国的盐渍化土壤面积约有1亿hm2,分布在我国的多个粮食和蔬菜主产区,而且其中有些地区还伴随着Mo的缺乏。不仅如此,中国约有2/3的土壤缺硒(Se)。Se同样也被称为逆境防御元素,施用Se肥也能提高作物对多种逆境的防御能力。如果在生产富硒蔬菜的同时又能兼顾提高蔬菜对盐渍化的防御能力,将会是一种很好的蔬菜生产模式。因此,研究钼(Mo)、硒(Se)单施和配施对缓解小白菜盐胁迫的效应既丰富和发展了植物Mo、Se研究理论,又在大田生产上有着重要的实践意义。本研究以小白菜(Brassica chinensisL.)为研究对象,从抗氧化作用、渗透调节作用等方面考察钼(Mo)、硒(Se)单施和配施对盐胁迫下小白菜生长的影响,旨在探明钼(Mo)、硒(Se)单施和配施对盐胁迫下小白菜的生长是否有着缓解作用以及是否能兼顾到生产富硒蔬菜。
1、材料与方法
1.1供试材料
试验采用盆栽方式进行,供试小白菜为上海青(Brassica chinensisL.),试验地点为华中农业大学微量元素研究中心盆栽场。供试土壤为采自武汉市新洲区的酸性黄棕壤,其中有机质含量2.06%、碱解N72.37mg/kg、速效P31.38mg/kg、速效K48.86mg/kg、pH值4.6、有效Mo0.09mg/kg、有效Se11.52μg/kg。试验时每盆盛土6.0kg,大量元素肥料纯N、P2O5、K2O的用量分别为0.20、0.15、0.20g/kg,肥源依次为尿素、NH4H2PO4和KCl;每千克土壤中加入1mL缺Mo的Arnon营养液(1000倍)作为微量元素肥料。
1.2试验设计
正常生长环境和盐胁迫生长环境均设4个处理,即CK、0.3mg/kgMo(Mo0.3)、0.4mg/kgSe(Se0.4)和0.3mg/kgMo+0.4mg/kgSe(Mo0.3Se0.4),分别以(NH4)2MoO4·4H2O(钼酸铵)和Na2SeO3(亚硒酸钠)为肥源,各处理重复8次,出苗后1周每盆定苗8株。大量元素肥料及微量元素肥料在播种前均配成溶液一次性施入土壤,整个生长期内采用去离子水浇灌,置于玻璃钢棚内防止雨水淋洗。盐胁迫采用分步胁迫的方式进行,分别在出苗后第10天、第20天和第30天添加500mL0.8%的NaCl溶液。
1)养分含量测定。取各处理相同部位的小白菜叶片,用去离子水迅速洗净并按待测指标个数分别装于盛有液氮的取样盒内,然后转存于超低温冰箱(-80℃)内以待分析。各处理剩余的4个重复用去离子水洗净后,先在105℃杀青30min,然后于65℃烘干至恒质量,最后样品经粉碎过筛后测定养分含量。
2)胡萝卜素(CAR)、可溶性蛋白、抗坏血酸(ASA)、脯氨酸含量、可溶性糖含量及膜透性的测定。胡萝卜素含量采用乙醇提取比色法测定,可溶性蛋白采用考马斯亮蓝法测定,抗坏血酸含量采用2,6-二氯靛酚滴定法测定,脯氨酸含量采用茚三酮比色法测定,可溶性糖采用蒽酮比色法测定,膜透性采用电导法测定。
3)抗氧化酶活性测定。POD活性采用愈创木酚法测定,CAT活性采用紫外吸收法测定,SOD活性采用NBT法测定,上述指标均参考李合生的方法测定。
4)GSH的测定。称0.5g小白菜样品加入5mL5%的三氯乙酸研磨,10000r/min下离心10min。取离心后的上清液0.25mL,加入0.18mLDTNB和2.6mL150mmol/L的NaH2PO4,以磷酸缓冲液作对照,30℃保温反应5min,分光光度计测定412nm的吸光度,根椐标准曲线计算样品中GSH含量。
5)Mo、Se、K、Na、Ca和Mg的测定。小白菜Mo含量采用催化极谱法测定;植株内Se含量采用原子荧光氢化物发生法测定。小白菜样品经消化后,溶液中的K+、Na+采用火焰光度法测定,Ca2+、Mg2+采用原子吸收分光光度法测定。
1.3数据处理
使用Excel2003进行数据处理,Sigmaplot10.0作图,各因素主效应分析采用F-test法,处理平均值的多重比较采用Duncan-test(P<0.05)法。
方差分析中,F(NaCl)表示盐胁迫的效应,F(Mo)表示Mo的主效应,F(Se)表示Se的主效应,F(NaCl×Mo)表示Mo和NaCl的交互作用,F(NaCl×Se)表示Se和NaCl的交互作用,F(NaCl×Mo×Se)表示Mo、Se及NaCl之间的交互作用,其中*和**分别表示F值检验显著性P<0.05和P<0.01,图中不同小写字母表示差异显著性P<0.05。
2、结果与分析
2.1Mo、Se单施及配施对小白菜产量的影响
盐胁迫导致小白菜产量显著(P<0.01)降低,单施Mo及Mo、Se配施不但显著地(P<0.05)提高了正常生长环境下小白菜的产量,而且也显著地提高了盐胁迫下小白菜的产量。同时也可以看出,单独施Se虽然提高了正常生长及胁迫环境下小白菜的产量,但均未达到显著水平(图1)。单施Mo及Mo、Se配施对小白菜产量提高的幅度基本相当,因此,Mo、Se配施并没有表现出显著的交互作用。结果表明,盐胁迫下小白菜遭受了严重的逆境伤害,而Mo、Se配施则对其有一定的缓解作用。
2.2Mo、Se单施及配施对小白菜Mo、Se含量的影响
盐胁迫显著降低了小白菜Mo的含量,而施Mo同时显著提高了正常生长条件下和盐胁迫条件下小白菜体内Mo的含量,改善了小白菜的Mo营养水平;Mo、Se配施不但显著促进了正常生长条件下小白菜对Mo的吸收,而且也促进了盐胁迫条件下小白菜对Mo的吸收(图2A)。尽管盐胁迫降低了正常生长条件下和盐胁迫条件下小白菜体内Se的含量,但是施Se同时提高了正常生长条件下和盐胁迫下小白菜Se的含量(图2B);Mo、Se配施同时促进了正常生长及胁迫环境下小白菜对Se的吸收,增加了Se的含量。
Mo、Se配施对小白菜Mo含量及Se含量均表现出了显著的交互作用。结果表明,施用Mo、Se可以很好地改善盐胁迫下小白菜的Mo、Se营养水平。
2.3Mo、Se单施及配施对小白菜细胞膜透性的影响
盐胁迫条件下细胞膜遭受到一定的损伤,对离子的选择透过性降低,增加了电解质的外渗。施Mo、施Se以及二者配施对正常生长环境下小白菜细胞膜透性影响不大,而施Mo及Mo、Se配施对盐胁迫下小白菜电解质的外渗有着缓解作用,有利于维持细胞膜的完整性,增强了小白菜细胞膜的选择透过能力,同时也可以看出单独施Se虽然对降低盐胁迫下小白菜电解质外渗有一定的作用,但并不显著(图3)。结果表明,施Mo及Mo、Se配施有利于维持细胞膜的完整性。
2.4Mo、Se单施及配施对小白菜抗氧化系统的影响
1)Mo、Se单施及配施对小白菜抗氧化酶活性的影响(图4A-C)。盐胁迫对超氧化物歧化酶(SOD)的活性有着显著的影响,同时施Mo也显著地提高了盐胁迫条件下小白菜体内SOD的活性,施Se以及Mo、Se配施没有影响到胁迫条件下小白菜SOD的活性。施Mo、施Se以及Mo、Se配施提高了盐胁迫条件下小白菜体内过氧化物酶(POD)的活性,施Mo以及Mo、Se配施的处理达到了显著水平。施Mo以及Mo、Se配施显著地降低了正常生长条件下小白菜体内过氧化氢酶CAT的活性,施Se对CAT活性影响不大;但是施Mo显著提高了盐胁迫条件下小白菜体内过氧化氢酶(CAT)的活性,施Se以及Mo、Se配施则对其影响不大,说明施Mo及Mo、Se配施对提高抗氧化酶类活性效果较好,能增强小白菜的抗氧化能力。
2)Mo、Se单施及配施对小白菜非酶类抗氧化物质含量的影响(图4D-F)。Mo、Se配施对正常生长条件下小白菜抗坏血酸(ASA)的含量有着显著的提高作用,而施Se以及Mo、Se配施对盐胁迫下小白菜ASA含量也有着较好的提高作用。施Mo以及Mo、Se配施对增加正常生长条件下小白菜胡萝卜素(CAR)的含量较为有效,但施Se并没有显著效果;盐胁迫致使小白菜CAR含量显著地降低,施Mo、施Se以及Mo、Se配施对盐胁迫下CAR含量的提升虽然有一定的效果但并不显著。施Mo、施Se以及Mo、Se配施对提高盐胁迫下小白菜GSH均有较好的效果,特别是施Mo以及Mo、Se配施效果最佳。结果表明,Mo、Se配施对提高非酶类抗氧化物质含量大多有着较好的效果。
2.5Mo、Se单施及配施对小白菜渗透调节系统的影响
Mo、Se单施及配施对小白菜有机渗透调节物质含量的影响见图5。施Mo以及Mo、Se配施对提高盐胁迫下小白菜可溶性糖的含量效果较好;施Mo及Mo、Se配施在一定程度上增加盐胁迫条件下小白菜可溶性蛋白的含量,并且单独施Mo处理可溶性糖含量得到了显著地提高。施Mo、施Se以及Mo、Se配施对正常生长环境下小白菜可溶性蛋白含量有着提高作用,而且施Mo及Mo、Se配施的处理达到了显著水平;施Se以及Mo、Se配施对提高盐胁迫下小白菜可溶性蛋白的含量也较为有效。
胁迫环境导致小白菜脯氨酸含量大量累积,而施Mo、施Se以及Mo、Se配施又能增加盐胁迫下小白菜脯氨酸含量。因此,单施Mo及Mo、Se配施对提高盐胁迫下小白菜的渗透调节能力较为有效,从而有助于小白菜对水分的吸收。
Mo、Se单施及配施对小白菜无机渗透调节离子含量的影响(图6)。施加氯化钠导致了小白菜K+的显著降低,但是施Mo、施Se以及Mo、Se配施增加了盐胁迫下小白菜体内K+的含量,并且施Mo及施Se的处理达到了显著水平。盐胁迫提高了小白菜体内Na+的含量,而施Mo及Mo、Se配施的处理显著降低了盐胁迫条件下小白菜体内Na+的含量,施Se虽然对盐胁迫下小白菜体内Na+含量有一定的降低作用但并不显著。施Mo、施Se以及Mo、Se配施对盐胁迫下小白菜Ca2+、Mg2+的含量均有着一定的提升作用。结果表明,Mo、Se配施有利于维持盐胁迫下小白菜体内渗透调节离子含量进而增强保持渗透调节平衡的能力。
3、讨论
盐胁迫会显著地抑制作物生长,导致作物产量大幅地降低,作物的抗逆性得到提高后生长状况就会得到好转,因此,能否增加作物的产量及生物量就成为判断植物对逆境防御能力强弱的重要标准。
本研究发现施Mo、施Se以及Mo、Se配施对盐胁迫下小白菜的产量有着提高作用,以单施Mo及Mo、Se配合施用的处理效果最好,说明在该处理下小白菜抵御盐胁迫的能力有了一定程度的增强。本试验中盐胁迫同时降低了小白菜体内Mo、Se的含量,可能是在盐胁迫环境下植物根系活力降低进而对养分元素的吸收能力变弱。
Mo是植物所必需的营养元素,施Mo可以提高小白菜的Mo营养水平,有利于保持正常的生长代谢;施Se也显著增加了盐胁迫下小白菜体内Se的含量。因此,从小白菜产量和Mo、Se含量上可以推断出Mo、Se配施增强了小白菜的抗盐胁迫能力。
植物在正常环境中生长时,植物体内产生的自由基相对较少,而且抗氧化系统的清除速率与自由基的产生速率基本相当,但是在植物遭受逆境时这个相对稳定的平衡状态就会被打破。清除这类活性氧自由基的物质包括抗氧化酶类物质如SOD、POD以及CAT等,此外还有一些非酶物质如ASA、GSH和CAR等,这个由酶类和非酶类物质组成的抗氧化系统对增强小白菜盐胁迫的抗性能力至关重要。本研究中施Mo能提高盐胁迫下小白菜体内SOD、POD和CAT的活性,而施Se以及Mo、Se配施的处理对这3种抗氧化酶活性影响不大,但是施Se以及Mo、Se配施却增强了小白菜细胞膜的选择透过性,这可能是因为Se自身的抗氧化能力具有较强的自由基清除功能,进而使得小白菜体内活性氧代谢维持在较低水平,而这3种抗氧化酶又是诱导酶,它们易受逆境环境下所产生自由基的诱导,因此,施Se以及Mo、Se配施的处理并没有增强这3种酶的活性。
非酶类抗氧化物质ASA对增强小白菜的抗氧化能力也十分重要。本试验中施Se以及Mo、Se配施的处理对盐胁迫下小白菜ASA含量均有着提高作用。研究表明,Mo能促进抗坏血酸的代谢循环,因此,施Mo可以提高ASA的含量。植物体内不同价态的Se本身就是很好的抗氧化物质,对清除自由基较为有效,可以减少ASA在清除自由基中的消耗量,进而增加了小白菜ASA的含量。在光合作用中具有吸收并传递光电子作用的胡萝卜素CAR同样也具有较强的抗氧化防御能力,施Mo、施Se以及Mo、Se配施同样也提高了盐胁迫下小白菜体内CAR的含量。
GSH能够清除H2O2和修复细胞膜损伤,施Mo、施Se以及Mo、Se配施对盐胁迫下小白菜体内GSH含量有提高作用。因此,Mo、Se配施可以通过提高小白菜抗氧化酶活性和非酶类抗氧化物质含量来增强小白菜在盐胁迫环境下清除活性氧自由基的能力。
在盐胁迫环境下植物根系吸收水分的能力大小是决定植物能否正常生长的关键因素,外界盐分浓度大、渗透压高,植物细胞失水,造成植物根系吸水困难。此时,为了缓解组织细胞内的渗透胁迫,植物需要进行渗透势的调节,加强一些小分子有机物溶质的合成代谢如脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等。研究发现,施Mo能提高盐胁迫下小白菜体内可溶性糖及脯氨酸含量,而施Se的处理能提高盐胁迫下小白菜体内可溶性蛋白及脯氨酸的含量,而Mo、Se配施的处理能同时提高小白菜可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸的含量。维持较高的钾钠比值是植物具有较强抗盐胁迫能力的重要生理特征,K+、Na+的离子半径及水合能较为相似,因此,Na+会与K+竞争质膜上的结合位点,有着较高的钾钠比值暗示着植物体内K+竞争结合位点的能力更强。小白菜对盐胁迫的防御能力就取决于能否保特较高的K+含量和限制较多的Na+进入植物体,钾钠比是用来判断植物抗盐能力强弱的重要参照标准。本研究中,施Mo、施Se以及Mo、Se配施提高了盐胁迫下小白菜K+的含量降低了Na+的含量,进而提高了小白菜的钾钠比,增强了小白菜对盐胁迫的防御能力。研究表明,Mo可以影响ABA的代谢,进而诱导基因GhNHX1的表达,而该基因表达的产物正是可以外排Na+的Na+/H+反向转运子。当植物感知到逆境信号时,细胞质中Ca2+浓度会发生变化,进而诱导钙调蛋白CAM活性变化,做出相应的生理调节。在盐胁迫时,Na+可以置换下质膜上的Ca2+,置换下的Ca2+进入细胞组织后,组织内的游离钙就会增多,Ca-CAM复合体的代谢调节功能就会紊乱。不仅如此,Ca2+还具有稳定细胞膜的作用,Ca2+的缺失还会降低细胞膜的选择透过性。
Mg作为叶绿素a和叶绿素b卟啉环的中心原子,在叶绿素合成过程中有着重要的作用,缺Mg会直接导致光合作用的降低,进而会影响到盐胁迫下抵御有害胁变所消耗的物质和能量供应。本试验中施Mo、施Se以及Mo、Se配施对盐胁迫下小白菜体内Ca2+、Mg2+的含量均有提高作用。因此,Mo、Se配施可以通过增强小白菜的渗透调节作用来提高小白菜对盐胁迫的防御力。
参考文献： [1]赵秋芳,胡承孝,孙学成.冬小麦不同钼效率品种钼吸收差异及其与根系形态特征的关系[J].华中农业大学学报,2013,32(2):67-71.