雄性花鼠免疫不育的防治研究
花鼠 Tamias sibiricus 属啮齿目松鼠科小型半树栖种，在我国东北、华北、陕西北部以及秦岭地区广泛分布（邹波等，1997） .花鼠通常取食树木和经济作物的种子以及各种坚果和浆果，对经济作物和林木造成严重破坏。花鼠不仅吃掉作物，而且会贮存大量作物种子，最多可达作物产量的 75% 以上，造成严重的经济损失（祁勐等，2009） .传统防治花鼠的方法包括笼捕法和毒饵法（周淑荣，2009） ,尽管在一定程度上可以达到控制花鼠数量和保护林木植物的目的，但普遍面临着工作量大、灭鼠效率低、效果差、专一性差、花鼠种群恢复快等问题。因此，寻求一种安全、高效、持久且专一性强的防治措施便成为了急需解决的问题（Córdoba et al. ,2006） .
不育控制的概念最早由 Knipling（1959） 提出，并在 20 世纪 90 年代初，免疫不育技术已涉及到了控制有害生物领域。不育技术通过控制雄性或雌性个体绝育或干扰胚胎着床发育，以降低生育率来控制种群数量。目前，有关免疫不育技术的研究已经成为不育控制鼠害的重点，免疫不育是指利用基因重组等分子生物学技术制造使有害生物产生不育的疫苗。21 世纪以来，重组病毒性不育疫苗已经接近实用化（张知彬，2000） ,其研究探索的主要方向是依靠携带不育疫苗的病毒在害鼠种群中传播，使不育疫苗在害鼠体内产生免疫反应，破坏生殖系统，导致害鼠不育（刘汉武等，2011） .由于抗原通常是自身蛋白类或核酸物质，具有特异性结合、对环境无污染、对非靶标动物安全等特点（张浩等，2013） .免疫机制一旦形成，终身具有免疫作用，因此目前在免疫不育研究方面的一个重要热点是，以精子表面抗原制备疫苗，诱导产生精子抗体并产生不育效果（孙美玉等，2009） .
乳酸脱氢酶 C（lactate dehydrogenase,LDH-C） 是一类四聚体寡聚酶，位于糖酵解途径的末端，能特异性地催化丙酮酸和乳酸之间的氧化还原反应。在哺乳动物中，LDH 存在 3 种类型的同工酶亚基： LDH-A、LDH-B 和 LDH-C.LDH-C 是组织特异的同工酶，哺乳动物中 LDH-C 基因只在成熟的睾丸组织中表达，且在成熟精子细胞里只存在 LDH-C4 一种形式（Burgos et al. ,1995） .已有研究表明，缺失 LDH-C 基因的雄性小鼠生育能力会严重降低 （Odet etal. ,2008） ,这也说明了 LDH-C4 是设计节育药物的一个很好的靶蛋白。事实上，已有试验以 LDH-C 为抗原制备抗体，并发现可以有效降低哺乳动物的生育能力（Wei et al. ,2001） .
我国的免疫不育疫苗研究还处于探索阶段，目前大多以雌性动物卵透明带为研究对象设计不育药物，其效果进展有限，对于雄性不育技术，尤其是花鼠的研究更是空白。因此，本试验针对雄性花鼠进行免疫不育的防治研究，通过克隆花鼠 LDH-C 基因编码区序列，对其翻译的氨基酸序列进行初步分析预测，并进行原核表达的初步探究，以期为蛋白研究和针对花鼠的不育鼠药研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试动物： 花鼠捕于陕西省西安市周至县，8 周龄左右。将花鼠饲养在实验室普通大号鸟笼，置于通风良好的安静房间，每只 20 cm 左右长度的花鼠每 2 天喂 1 块蛋糕，每 3 天换 1 次清水，放 1 个苹果，每周清理 1 次排泄物。
试剂： RNA 提取试剂盒、ES Taq MasterMix、DNAMarker、核酸上样缓冲液、抗 His 单克隆抗体、羊抗鼠IgG-Biotin 均购自北京康为世纪生物科技有限公司；琼脂糖购自美国 HyraGene 公司； 反转录试剂盒购自立陶宛 Fermentas 公司； PCR 试剂盒购自东洋纺生物科技有限公司； 高效琼脂糖 DNA 凝胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京） 有限公司； pMD19-T 载体、IPTG、X-gal 均购自日本 TaKaRa 公司； 氨苄青霉素购自北京索莱宝科技有限公司； 酵母提取物和蛋白胨购自英国 OXOID 公司； 感受态细胞 DH5α 和蛋白质Marker 购自北京全式金生物科技有限公司； 牛血清蛋白购自瑞士 Roche 公司； Tween -20 购自德国 Sigma-Aldrich 公 司； HRP-Sterptavidin 结 合 物 购 自 美 国ZYMED 公司； 其它试剂均为国产分析纯。
仪器： 9700 型 PCR 仪，美国应用生物系统公司； 5424R 高速冷冻离心机，德国艾本德股份公司；Gel Doc XR + 凝胶成像系统，美国 Bio RAD 公司；NANOPAC-300 型电泳仪，英国 Cleaver Scientific 有限公司； DYCZ-24DN 型迷你蛋白双垂直电泳槽和DYCZ-40D 型转膜电泳仪，北京六一仪器厂。
1. 2 方法
1. 2. 1 花鼠睾丸总 RNA 提取及第一链 cDNA 合成
花鼠解剖后取睾丸组织迅速放入液氮中保存，取约 50 mg 睾丸组织置于研钵中，液氮研磨成粉末状，按照康为世纪超纯 RNA 提取试剂盒步骤操作提取总 RNA.第一条 cDNA 链合成按照 Fermentas 反转录试剂盒步骤操作进行。
1. 2. 2 LDH-C 基因克隆
根据 GenBank 已经收录的多纹黄鼠 Spermophi-lus tridecemlineatus LDH-C 基因的 mRNA 序列（XM_005326851. 1） ,针对整个 CDS 区设计特异性引物，并委托生工生物工程（上海） 股份有限公司合成。
设计的引物序列如下： 上游引物： 5'-ATGTCAACT-GTCAAGGAG-3',下 游 引 物： 5'-TTAAAATTCCA-GATCCTTTTG-3'.以合成的 cDNA 链为模板进行PCR 扩增。反应体系为 25 μL,其中模板 1 μL、上下游引物各 1 μL、灭菌水 9. 5 μL、ES Taq MasterMix12. 5 μL.反应条件为： 94 ℃ 预变性 5 min,94 ℃ 30s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,72 ℃ 7 min,循环 35 次，4℃ 结束反应。产物以 1. 0% 琼脂糖凝胶电泳检测结果。PCR 产物经胶回收纯化后，连接到 pMD19-T 载体上，随后转化到 DH5α 感受态细胞中，取 30 μL 涂布于含氨苄青霉素（ampicillin,Amp） 的 LB（luria-bertani） 固体培养基，37 ℃ 培养 12 h 后，挑取单克隆菌落接种于含 Amp 的 LB 液体培养基中，振荡过夜培养。菌液 PCR 验证后，筛选阳性转化子送生工生物工程（上海） 股份有限公司测序。
1. 2. 3 花鼠 LDH-C 基因序列分析用 DNAMAN 软件进行氨基酸推测。蛋白质分子量、等电点和氨基酸组成的分析用 Expasy Protpar-ma在线工具。蛋白质跨膜区的预测、信号肽和二级结构的预测采用 CBS Prediction Servers （www. cbs. dtu. dk/serv-ices / ） 进行分析。
1. 2. 4 原核表达载体的构建与鉴定
根据测序得到的序列分析含有的酶切位点，设计 1 对不含其序列中酶切位点的引物，并加保护碱基。引物序列如下： 上游引物： 5'-CGAGCTCATGT-CAACTGTCAAGGAG-3‘（下划线部分为 Sac Ⅰ 酶切位点） ,下 游 引 物： 5'-CCTCGAGTTAAAATTCCA-GATCCTTTTG-3’（下划线部分为 XhoⅠ酶切位点） .
以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，反应条件和体系与1. 2. 2 相同。产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳验证后，在紫外灯下切胶进行回收。回收产物经 SacⅠ和 XhoⅠ双酶切后，与 pET-28a（+ ） 连接，连接反应总体积10 μL,其中目的基因 4. 5 μL、载体 0. 5 μL、SolutionI Buffer 5 μL,16 ℃ 连接过夜。
将连接产物转化到 BL21（DE3） 中，涂布于含卡那霉素的 LB 固体培养基上，37 ℃孵育过夜。以挑取的单克隆菌落摇菌液为模板进行 PCR 扩增，参数同 1. 2. 2.经琼脂糖凝胶电泳验证判断菌体是否含有重组质粒。提取质粒后进行 Sac Ⅰ和 Xho Ⅰ单双酶切验证，以观察是否含有目的 DNA.重组质粒委托生工生物工程（上海） 股份有限公司进行测序。
1. 2. 5 重组蛋白诱导表达及检测
取400 μL 过夜培养菌，接种于20 mL 含卡那霉素的 LB 培养基，37 ℃培养至 OD600约为 0. 4 ~0. 6,加入异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside,IPTG） 至终浓度为 1 mmol / L,28 ℃ 条件下诱导 5 h.取1 mL 菌液12 000 r/min 离心10 min 去上清，经磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS） 洗涤后加入 150 μL 蛋白缓冲液，煮沸 10 min,12 000 r/min离心取上清，10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium do-decyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE） 电泳鉴定。
用上述方法先进行 SDS-PAGE,再用半干电转移系统将重组蛋白由凝胶转印至硝酸纤维素膜上（转移参数为 15 V × 30 min） .将硝酸纤维素膜置于含 1%牛血清蛋白的 PBS 中，4 ℃ 封闭过夜。用含 0. 05% Tween - 20 的 PBS 洗涤 3 次，每次 10min,加入 1∶ 1 000稀释的抗 His-Tag 单克隆抗体，室温下孵育 1 h,洗涤 3 次，加入 1∶ 20 000 稀释的羊抗鼠 IgG-Biotin（二抗） ,室温下孵育 l h.洗涤 3 次，再加入1∶ 1 000稀释的 HRP-Sterptavidin,室温下孵育 1h.用不含 Tween - 20 的 PBS 洗涤 5 次，每次 5 min,加入底物液（含 4-氯-1-萘酚） 显色 5 ~ 10 min,蒸馏水冲洗以终止显色。
2 结果与分析
2. 1 花鼠 LDH-C 基因 cDNA 克隆及重组载体的鉴定
以花鼠睾丸总 RNA 为模板，根据设计的特异性引物，利用 RT-PCR 扩增后经电泳检测得到了一条约 1 000 bp 大小的 DNA 片段，经连接、转化的重组载体进行蓝白斑筛选后，挑取白色转化菌落，以菌液为模板进行 PCR 验证，琼脂糖凝胶电泳验证表明，得到与预期大小一致的片段长度（图 1） .初步判断已成功构建了测序载体。
2. 2 LDH-C 的序列分析及蛋白质结构分析
测序结果显示，克隆的片段全长为999 bp,编码一个完整的开放阅读框（1 ~ 999） ,碱基组成为 A（28. 2%） 、T（30. 0%） 、C（17. 2%） 、G（24. 5%） .共编码 332 个氨基酸，其中，亮氨酸（Leu） 、丝氨酸（Ser） 、缬氨酸（Val） 比例最高，均超过 10%,负电荷残基（Asp + Glu） 与正电荷残基（Arg + Lys） 均为 36个（图 2） .
ProtParam 软件分析结果显示，花鼠 LDH-C 的理论分子量为 37 kD,理论等电点 PI 为 7. 04,GRA-VY（grand average of hydropathicity） 值为 0. 087.用SignalP 4. 1 预测信号肽结果表明 LDH-C 不存在信号肽，经 TMHMM 软件分析推测 LDH-C 也不具有跨膜区，推测是一种非分泌、疏水性蛋白。
SOPMA 分析表明 α 螺旋、无规则卷曲以及延伸链是 LDH-C 蛋白二级结构的主要成分。LDH-C蛋白二级结构中含有 42. 47% α 螺旋、29. 82% 无规则卷曲、20. 78% 延伸链和 6. 93% β 转角。通过Phyre2 同源建模得到花鼠 LDH-C 三维结构模型（图 3） ,其中有 330 个氨基酸残基与数据库中一个LDH-C 蛋白结构模板相似度达 99% ,置信度为 100% .
2. 3 原核表达载体鉴定
重组载体经转化后，进行单双酶切，经 1% 琼脂糖凝胶电泳验证后得到如下结果（图 4） .经 Sac Ⅰ和 Xho Ⅰ单酶切的载体均出现一条约 7 000 bp 条带，双酶切后的载体含有 2 条亮带，其中一条与已知的 LDH-C 基因 DNA 相同，约 1 000 bp,另外一条带略小于单酶切的条带。初步判定重组表达载体构建成功。经生工生物工程（上海） 股份有限公司测序后，确定插入的 DNA 片段与已知 LDH-C 片段完全一致。
2. 4 重组蛋白诱导表达及鉴定
经鉴定的转化菌，经 IPTG 诱导后，表达产物经10% SDS-PAGE 电泳，在 40 kD 附近出现了 1 条较浓的蛋白质区带（图 5-a） ,与预期的目的蛋白 37 kD分子量大小相符，携带空载体的菌体 IPTG 诱导前后未见菌体全蛋白变化。IPTG 诱导后的重组菌表达的一个蛋白质可以被抗 His-Tag 单克隆抗体识别（图 5-b） ,从而显示特异性蛋白区带，其位置与诱导产物一致，表明 LDH-C 蛋白诱导表达成功。
3 讨论
研究基于精子抗原的免疫不育疫苗是一种具有前景并能有效控制种群的方法 （Naz & Rajesh,2004） .免疫不育法是通过降低生育率控制种群数量，并且不育个体干扰种群繁殖，消耗资源，能够有效控制种群恢复的速度（刘汉武等，2008） .LDH-C是精子能量代谢过程中的一个重要酶，其主要分布在精子胞质和线粒体基质内。Odet et al. （2008） 通过基因剔除的方法对缺失 LDH-C 的小鼠进行生育试验发现，精子功能的缺失造成了极端的不育效果，推测是因为 LDH-C 缺失的精子在移动方式和移动时间上均受到极大限制。而体外受精试验也表明，缺失 LDH-C 基因的精子不能使卵子受精。这也表明 LDH-C 基因是研究花鼠免疫不育疫苗极好的研究对象。本研究在进行预试验时，根据 6 种不同动物（小家鼠 Mus musculus、褐家鼠 Rattus norvegicus、高原鼢鼠 Myospalax baileyi、人 Homo sapiens、赤狐Vulpes vulpes、家兔 Oryctolagus cuniculus） 的 LDH-C 序列保守片段设计了简并引物并获得了 609 bp 花鼠LDH-C 片段，经 BLAST 比对显示与多纹黄鼠相似度为 97%,因而尝试以多纹黄鼠 LDH-C 序列编码区为模板设计特异性引物，最终得到了花鼠 LDH-C 序列完整编码区，经比对、验证分析，表明其编码的氨基酸序列含有 LDH-C 特有的保守序列元件。在将LDH-C 与 NCBI 数据库中已经登录的 14 种动物LDH-C 编码的氨基酸序列进行多重比对，构建基于邻接法的系统进化树时，也发现花鼠 LDH-C 与已知的啮齿鼠类动物具有较高的同源性。
本研究将 LDH-C 编码序列插入原核表达载体pET28a（+） 多克隆位点的 SacⅠ与 XhoⅠ之间，构建了重组质粒 pET28a-sLDH-C.根据该载体阅读框架特点，在插入序列的 5‘端上游存在 126 bp 的可读序列，编码 42 个氨基酸残基，其中包括 6 个组氨酸残基组成的 His-Tag.因此表达的 LDH-C 链实际上是一条融合的多肽链： 除 LDH-C 固有氨基酸序列外，N端有一小段附加序列。唐威华等（2000） 发现，由于组氨酸标签携带较强的正电荷，降低了蛋白在 SDS-PAGE 中的电泳速率，从而导致表观的分子量偏大，这也解释了在 SDS-PAGE 电泳结果中，第 6 泳道的条带比预计位置更加靠近 40 kD.因此，在研究含有组氨酸标签的融合蛋白时，SDS-PAGE 电泳只能作为表达的初步检测而不能作为蛋白分子量确定的依据，本研究后续试验也将对此进行探索。