鼠源环丙沙星多克隆抗体的制备
摘 要：为了制备环丙沙星(CPLX)多克隆抗体，将修饰成功的CPLX-NH2分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联，制备完全抗原—CPLX-NH2-BSA和CPLX-NH2-OVA，用CPLX-NH2-BSA免疫小鼠，获得了高效价的环丙沙星多克隆抗体。
关键词：
关键词：环丙沙星; 偶联; 多克隆抗体
环丙沙星又名环丙氟哌酸(Ciprofloxacin，CPLX)，抗菌谱广，抗菌活性较诺氟沙星强。但作为一种人畜共用药，其在动物源食品中的残留对人体产生极大危害，从1997年8月20日起，美国禁止将氟喹诺酮类药物作为非限制性药物使用，欧盟规定了环丙沙星与恩诺沙星的合计最高残留限量为30 μg/kg。
本研究利用已修饰成功的合成物—CPLX-NH2，与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫抗原CPLX-NH2-BSA，免疫小鼠制备环丙沙星多克隆抗体。
1 材料和方法
1.1 材料 CPLX-NH2由河北北方学院食品安全研究中心制备;牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)购于Sigma公司;辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG由北京中杉金桥生物技术有限公司提供;25%戊二醛、TMB显色液购于北京索莱宝科技有限公司。
HITACHI紫外、可见及近红外分光光度计U-3900购于HITACHI公司，MULTISKAN MK3酶标仪购于Thermo Scientific公司。
6周龄昆明小鼠5只，由河北北方学院提供。
1.2 方法
1.2.1 完全抗原的制备 取30 mg CPLX-NH2，溶于3 mLDMF+2 mL包被液中，充分溶解，得A液;100 mgBSA溶于6 mLPBS液中，得B液;将A液滴加到B液中，边搅拌边滴加100 μL戊二醛(25%)，室温反应4 h，得透明偶联物，PBS液4 ℃透析72 h，6 h换液1次，离心取上清，得免疫抗原CPLX-NH2-BSA，-20 ℃冻存。
将OVA代替BSA制备检测抗原CPLX-NH2-OVA。
1.2.2 完全抗原的鉴定 分别对CPLX-NH2、BSA、OVA和2种偶联物的PBS溶液进行紫外光谱扫描，波长范围200～400 nm，并对扫描图进行组合[1]。
1.2.3 抗体制备 腹腔多点注射免疫，1次/2周，共5次，具体参照梁淑珍[2]的方法进行，第5次免疫后1周眼眶静脉采血，室温静置1 h，4 ℃静置过夜，3 000 r/min离心20 min，取上清，间接ELISA法测定抗体效价，分装，-20 ℃保存。
2 结果
2.1 完全抗原鉴定结果 CPLX-NH2的最大吸收峰在270.8 nm处，BSA的最大吸收峰在278.4 nm处，CPLX-NH2-BSA的最大吸收峰在271.6 nm处，介于两者之间，三者光谱不相同(见图1)。说明BSA上成功连接上了目的物小分子CPLX-NH2，可用作动物免疫。
注：1.CPLX-NH2，2.CPLX-NH2-BSA，3.BSA。
图1 免疫抗原的紫外扫描光谱
如图2所示，CPLX-NH2、CPLX-NH2-OVA和OVA的最大吸收峰分别在270.8 nm、273.8 nm和279.2 nm，同理可证，目的物小分子CPLX-NH2与OVA成功连接，可用做检测抗原进行包被。
注：1.CPLX-NH2，2.CPLX-NH2-OVA，3.OVA。
图2 检测抗原的紫外扫描光谱
2.2 抗体效价的测定 ELISA测定抗体效价，均达1：32 000以上，最高达可达1：128 000，CPLX-NH2多克隆抗体制备成功。
3 讨论
CPLX-NH2分子量为389.3，是小分子物质，只有反应原性而没有免疫原性，将其与大分子蛋白质(BSA和OVA)偶联，才能获得免疫原性，刺激机体产生抗体，实验结果显示产生了持续恒定的CPLX多克隆抗体，说明实验方法是有效的，可进行进一步的研究。
参考文献
[1] 陈新建，陈梅英. 免疫学技术在植物学中的应用. 北京：中国农业出版社，1998： 54-58.
[2] 梁淑珍，孙秀梅，魏东. 二氟沙星抗体的制备. 安徽农业科学，2012，40(13)： 7742-7743，7754.