诺氟沙星多克隆抗体的制备

　　诺氟沙星多克隆抗体的制备

　　摘　要：为了制备诺氟沙星(NFLX)抗体，将修饰成功的NFLX-NH2分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联，制备完全抗原，用免疫抗原免疫小鼠，获得了高效价的诺氟沙星多克隆抗体。

　　关键词：

　　关键词：　诺氟沙星; 抗原; 多克隆抗体

　　诺氟沙星(Norfloxacin，NFLX)又称氟哌酸，抗菌谱广、抗菌作用强，对兽医临床常见病原菌，特别是霉形体感染有较强作用。但长期或过量使用于动物，会在其组织中残留，人类食用动物源性食品后，对人体亦造成危害。

　　本研究利用已修饰成功的合成物—NFLX-NH2，分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联，制备完全抗原，免疫小鼠制备诺氟沙星多克隆抗体，为动物源性食品中诺氟沙星残留的快速检测方法的研究做准备。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　NFLX-NH2由河北北方学院食品安全研究中心制备;牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)购于Sigma公司;辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG有北京中杉金桥生物技术有限公司提供;25%戊二醛、TMB显色液购于北京索莱宝科技有限公司。

　　HITACHI紫外、可见及近红外分光光度计U-3900购于HITACHI公司，MULTISKAN MK3酶标仪购于美国Thermo Scientific公司。

　　6周龄雌性昆明小鼠5只，由河北北方学院提供。

　　1.2　方法

　　1.2.1　完全抗原的制备　30 mg NFLX-NH2，溶于3 mLDMF+3 mL包被液中，得A液;100 mg BSA溶于6 mL PBS液中，得B液;将A液滴加到B液中，边搅拌边滴加100 μL戊二醛(25%)，室温反应4 h，将偶联物于PBS液中4 ℃透析72 h，6 h换液一次，离心取上清，得免疫抗原NFLX-NH2-BSA，-20 ℃冻存。

　　将OVA代替BSA制备检测抗原。

　　1.2.2　完全抗原的鉴定　分别对NFLX-NH2、BSA、OVA和2种偶联物NFLX-NH2-BSA与NFLX-NH2-OVA进行紫外光谱扫描，波长范围200～400 nm，定性证明是否偶联成功[1]。

　　1.2.3　抗体制备　腹腔多点注射免疫小鼠，1次/2周，共5次，参照梁淑珍[2]的方法进行。第5次免疫后7 d眼眶静脉采血，室温静置1 h，4 ℃下放置过夜，3 000 r/min离心20 min，收集上清，间接ELISA法[3]测定抗体效价，分装，-20 ℃保存。

　　2　结果

　　2.1　完全抗原鉴定结果　NFLX-NH2的最大吸收峰在271.6 nm处，NFLX-NH2-BSA最大吸收峰在272.8 nm处，BSA的最大吸收峰在278.4 nm处(见图1)，说明目的物小分子NFLX-NH2与载体蛋白BSA已经成功连接上了，可用作动物免疫。

　　注：1.NFLX-NH2，2.NFLX-NH2-BSA，3.BSA。

　　图1　免疫抗原的紫外扫描光谱

　　同理，NFLX-NH2、NFLX-NH2-OVA和OVA的最大吸收峰分别在271.6 nm、273.8 nm和279.2 nm处(见图2)，同样说明NFLX-NH2与OVA成功连接，可用做检测抗原进行包被。

　　注：1.NFLX-NH2，2.NFLX-NH2-OVA，3.OVA。

　　图2　检测抗原的紫外扫描光谱

　　2.2　抗体效价测定　间接ELISA小鼠抗体效价，效价均达1：64 000以上，证明NFLX-NH2多克隆抗体制备成功。

　　3　讨论

　　半抗原单独进入机体不能刺激机体免疫系统产生抗体和致敏淋巴细胞，必须要与大分子蛋白质载体结合，成为大分子量的完全抗原，免疫动物而诱导机体产生特异性抗体。因此，本研究先将NFLX-NH2分别与大分子蛋白BSA和OVA偶联，生成完全抗原，其既具有反应原性又具有免疫原性，进而刺激机体产生抗体。本实验成功制备了NFLX多克隆抗体，将有利于进一步的快速检测方法的研究。

　　参考文献

　　[1]　陈新建，陈梅英. 免疫学技术在植物学中的应用. 北京：中国农业出版社，1998： 54-58.

　　[2]　梁淑珍，孙秀梅，魏东. 二氟沙星抗体的制备.安徽农业科学，2012，40(13)： 7742-7743，7754.

　　[3]　Tijssen P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassay. Amsterdam：Elsever，1985：83-85.