摘要：[目的]对2019年售零售散装烟叶进行小规模的转基因成分抽样检测，及时发现相关情况，为相关调查和科研提供参考。[方法]在贵阳(含三县一市)地区农贸市场上随机抽样共30批次，参考GB/T24310-2009进行制样检测。[结果]所抽检产品中检出Nr内源基因，未检出pCaMV35S、NPTII、tNOS等转基因成分。[结论]本次抽检的贵阳市零售散装烟叶中并未发现含有转基因成分的批次。
关键词：零售散装烟叶;转基因成分检测;荧光PCR
1983年世界首例转基因作物，即转基因烟草，在美国研发成功;1994年，美FDA批准Monsanto公司的延熟保鲜转基因西红柿在美上市;2015年，AquaBounty的转基因三文鱼在加拿大上市。仅不到40年，转基因物种就从研发到食用、从植物到动物，广泛运用于实际生产并产生了巨大的社会和经济效益;随之而来的是，众多人工物种在短时间内广泛深入了人类社会和自然环境的诸多方面，带来了巨大而难以预料的安全风险，成为了舆论关注的重要热点。烟草作为转基因模式作物，研究最早、范围较广[1]，我国发布的转基因烟草的相关规范有国烟法[1998]168号《烟草基因工程研究及其应用管理办法》、国烟科[2003]387号《国家烟草专卖局关于加强对转基因烟草监控的通知》，在2005—2006年还陆续传达了加强出口烟草转基因检测的几个文件。本地市场上烟农贩售的散装烟叶，具有一定的手工风味和少量的市场规模，但转基因成分检测研究较少。为初步了解售零售散装烟叶是否含有转基因成分及其所占比例，在地区农贸市场上进行随机抽样，依据GB/T24310-2009《烟草及烟草制品转基因检测方法》、参考SN/T1200-2003《烟草中转基因成分定性PCR检测方法》进行检测，结果分析如下。
1材料与方法
抽样：均为地区农贸集散市场的临时摊位上随机抽样，抽样范围为零售散装烟叶共30批次。
2方法
检测方法：根据GB/T24310-2009《烟草及烟草制品转基因检测方法》所列检测基因(表1)及其引物、探针序列，由上海生工生物有限公司进行合成。阳性对照购自中检院，为CaMV35S、NPTII、NOS、Bt-cry1A(c)、Cpti、EPSPS、CMV、PVY、TMV、CMVsat、PVYnib、T54D阳性质粒，阴性对照为本实验室留存的非转基因烟草样品(贵烟4号)、空白对照为3dH2O。荧光PCR试剂为QuantiTectMultiplexPCRKit，荧光PCR体系配置及反应参数按上述试剂盒说明书，用荧光PCR仪ABI7500Fast检测。
3结果
30批次的内源基因NR均有明显荧光S形曲线增长，且Ct值<30.0，表明均提取到烟草DNA;外源基因筛选检测的CaMV35S、NPTII、NOS均未发现荧光信号增长，且Ct值>40.0，表明未检出相关转基因成分，由此，外源基因品系鉴定的Bt-cry1A(c)、Cpti、EPSPS、CMV、PVY、TMV、CMVsat、PVYnib、T54D也无需检测。如图1所示例，零售散装烟叶前3批次样品均如上所述。阳性对照、阴性对照、空白对照的检测结果均符合试剂盒说明书要求(图略)。
4讨论
DNA提取：传统的CTAB、SDS法提取样品DNA，虽然纯度和得率较高，但比较依赖实验人员经验，如在酚类、异丙醇、乙醇等萃取阶段，肉眼无法观察到沉淀时，所需操作水平要求较高，不利于规模化检测[5];主流的DNA提取试剂盒、核酸提取工作站等，虽然具有模式化、便捷化的优点，但也存在成本高、时间长的缺点[6]。在实际工作中，种子、鲜叶、初烤、片烟、卷烟等相对其他食品具有加工过程少、组织保存相对完好的特点，其DNA损失量较小，更适宜采用快提法[7-9]配合内源基因检测，同样可避免假阴性结果。检测方法：当前鉴定烟草中转基因成分的主流技术手段，是通过PCR方法检测样品DNA中目的基因进行鉴定[10-11]。由于烟草是最早进行转基因研发的模式植株，其外源基因种类较多，标准覆盖面不尽完善，如FMV35S启动子、Cry杀虫毒蛋白家族、EPSPS抗草丁膦蛋白家族、PAT抗草丁膦蛋白家族等、各种抗病毒品系等也可纳入检测内容。此外，关于检测烟草中转基因成分含量，目前行标SN/T1200-2003为定性、国标GB/T24310-2009兼有定性和定量、有文献建立定量方法[12];虽然通过荧光PCR进行定性检测的操作和判定较为简单，但对于实际生产来说，通过标物及标曲为基础的定量检测更具有实用价值和实际意义。
《零售散装烟叶转基因成分研究》来源：《农村实用技术》，作者：陈永芳 董睿