糖尿病是全球性健康问题,发病率近几十年呈不断上升趋势,80%以上2型糖尿病(T2DM)患者伴随肥胖。T2DM的主要病理特征是胰岛素及瘦素抵抗,由此导致糖、脂肪、蛋白及电解质代谢紊乱,常并发肥胖、高血压、血脂异常及动脉粥样硬化等,称为“代谢综合征”,影响患者的生活质量及寿期。
亚洲国家应用传统中医药治疗糖尿病已有几千年历史,五加科人参属植物三七作为一种重要药材已在 中 国 应 用 近600年,三 七 总 皂 苷 (Panaxnotoginseng saponins,PNS)是三七中的主要活性成分,我们研究发现三七根部提取的PNS对T2DMKK-Ay鼠具有抗高血糖、抗肥胖作用。
我们前期研究分析PNS成分发现,其主要含人参皂苷Rb1(Rb1)、人参皂苷Rg1(Rg1)、人参皂苷Rd(Rd)、人参皂苷Re(Re)及三七皂苷R1(R1)五种皂苷。其中Rg1、R1、Re属原人参萜三醇皂苷,Rb1和Rd为人参萜二醇皂苷。已有文献报道Rb1和Rg1均能促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌并减少甘油三酯的蓄积,Rb1能在体外活化过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ),亦有文献报道Re对肥胖T2DM小鼠有降糖、降胰岛素作用。
本实验将通过研究PNS对KK-Ay鼠胰岛素和瘦素调节作用的影响,探讨PNS抗高血糖和抗肥胖的机理,并探讨PNS中发挥降血糖作用的主要有效成分,旨在为抗糖尿病新药研发及PNS的临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物
10周龄SPF级雄性KK-Ay鼠,体质量为28~31g,合格证号:SCXK(京)2005-0013,标准全价营养饲料,均由中国医学科学院实验动物研究所提供;10周龄SPF级雄性C57BL/6J鼠,体质量为20~23g,合格证号:川实动管质第09号,由四川大学华西医学实验动物中心提供,标准钴60照射饲料,成都达硕生物科技有限公司。动物单笼饲养,12h昼夜交替光照,室温20~24 ℃,湿度50%~60%,自由摄食、饮水,实验前适应性饲养1周。
1.2 药品试剂与仪器
三七药材购于云南文山,由中国药品生物制品检定研究所鉴定;PNS(批号:110870-200201)、Rb1(0.984%,批号:110704-200318)、Rg1(0.989%,批号:110703-200322)、Rd(0.981%,批号:050402)、Re(0.985%,批号:0754-9911)及R1(0.985%,批号:110745-200313)对照品,均由中国药品生物制品检定所提供;胰岛素放免分析试剂盒(北京北方生物技术研究所);瘦素ELISA试剂盒(上海江莱生物科技有限公司);TC、TG诊断试剂、罗康全活力型血糖试纸(均为美国Roche诊断试剂厂)。
LC-10A型高效液相色谱仪,日本岛津公司;UV-2102C型紫外可见分光光度计,上海尤尼柯仪器有限公司;罗康全活力型血糖仪,德国罗氏公司;SN6-95B型智能放免γ测量仪,上海原子核研究所;FAME24/20型全自动微孔板ELISA分析仪,瑞士HAMILTON公司;Olympus AU5400型生化分析仪,日本Olympus公司;MDF-382E型超低温冰箱,日本SANYO公司。
1.3 方法
1.3.1 PNS分析PNS的成分分析参考文献进行。前期研究的比色法测定,三七根部提取物的总皂苷含量高于99%。高效液相色谱法测定各种皂苷含量,即人参皂苷Rb1、Rg1、Rd、Re及三七皂苷R1,含量分别为29.9%、20.5%、7.96%、6.83%及2.74%,其中三七皂苷R1是PNS中的特有成分,人参总皂苷中不含该成分。
1.3.2 PNS,R1及Rb1、Rg1、Rd、Re的配制实验前分别将PNS、Rb1、Rg1、Rd、Re、R1溶于生理盐水注射液,PNS、Rb1、Re于常温下溶解,R1、Rd、Rg1于70℃水浴加热溶解。根据PNS中各皂苷的百分 含 量,200 mg/kg体 质 量 的PNS相 当 于60mg/kg体质量Rb1、40mg/kg体质量Rg1、15mg/kg体质量Rd、14mg/kg体质量Re和6mg/kg体质量R1组成,配制的20mg/L PNS生理盐水为微黄色澄明溶液,6mg/L Rb1、4mg/L Rg1、1.5mg/L Rd、1.4mg/L Re、0.6mg/L R1生理盐水均为无色溶液,上述溶液均用于腹腔注射给药。
1.3.3 动物分组与给药实验前动物禁食6h,不禁水。将健康C57BL/6J鼠设为正常对照组,KK-Ay鼠选空腹血糖(FBG)≥13.89mmol/L者随机均分为模型组、PNS组及Rb1、Rg1、Rd、Re、R1组,每组6只。正常对照组和模型组均注射生理盐水10mL/kg体质量。各实验组按其分组选择对应剂量注射,均为10mL/kg体质量。正常、模型和PNS组连续给药30d,Rb1、Rg1、Rd、Re、R1组连续给药12d,均于每天早8∶00腹腔注射给药1次。
1.3.4 指标测定所有组于给药第0、12d(Rb1、Rg1、Rd、Re、R1治疗结束时)及30d(PNS治疗结束时)8∶30动物禁食,14∶30称体质量、尾尖采血,葡萄糖氧化酶法测各组鼠FBG。以药后体质量值-药前体质量值)/药前体质量值×100%计算体质量增长率。除禁食外,每天给药前称量食物,计算日均摄食量。
正常组、模型组、PNS组给药第0、30d测FBG后,立即腹腔注射葡萄糖1g/kg体质量,并于0、30、60、120min测血糖,计算0~120min的血糖曲线下面积(AUC)以评估糖耐量情况。给药30d,正常组、模型组、PNS组禁食8h后,乙醚麻醉摘眼球取血,3 000r/min离心10min,取血清,测生化指标。放射免疫分析法法测血清胰岛素,酶联免疫分析法法测瘦素,酶法测甘油三酯和胆固醇。取血后,小鼠立即股动脉放血处死,取附睾脂肪垫称重。胰岛素抵抗指数(IRI)用HOMA-IR法计算:IRI=空腹血糖浓度×血浆胰岛素浓度/22.5。
1.3.5 统计学方法实验数据均以珚x±s表示,方差齐则多组间比较采用单因素单方差分析,进一步两两比较采用LSD法;方差不齐则采用Dunnett’sT3法。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 KK-Ay鼠12d时体质量和摄食量变化由表1可知,模型组和各实验组在0d、12d体质量及0~12d平均日摄食量均高于正常对照组(P<0.01),但体质量增长率的差异无统计学意义(P>0.05)。Rb1、Rg1、Rd、Re、R1组与模型组相比,上述指标差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.2 KK-Ay鼠30d的FBG变化结果见图1。各组KK-Ay鼠的FBG均明显高于C57鼠正常对照组(P<0.05)。给药前(0d),PNS、Rg1、Rd、Re、R1及模型组与正常组相比,P均<0.01;给药12d,PNS、Rb1组与模型组相比FBG下降(P<0.05),Re、Rg1、Rd、R1组与模型组相比差异无统计学意义(P均>0.05)。给药30d,PNS组的FBG与模型组相比进一步下降(P<0.01)。【表1】 2.3 KK-Ay鼠30d时糖耐量变化由图2A可知,给药前(0d)PNS组及模型组与正常对照组比,存在高血糖症,且在腹腔注射葡萄糖后PNS组和模型组的血糖进一步升高,120min后未降回基础水平,表明PNS组和模型组的糖耐量升高。由图2B可知,给药30d,与模型组相比,PNS组的血糖AUC下降了40%(给药前为24.06min·mmol/L,给药30d降至14.42min·mmol/L),表明PNS能改善KK-Ay鼠的糖耐量(P<0.01)。
2.4 KK-Ay鼠30d时胰岛素、瘦素抵抗,体质量、摄食量、脂肪组织及血脂的变化由表2可知,与模型组比,PNS给药30d后,血清胰岛素、IRI、瘦素、体质量增长率、摄食量、附睾脂肪垫质量、甘油三酯均下降(P<0.05或P<0.01).
PNS组和模型组的血清胆固醇水平差异无统计学意义。12~30d体质量变化率低于正常对照组。【图1】 3 讨论
KK-Ay鼠是一种啮齿类的遗传型瘦素耐受模型,由于异位表达剌鼠蛋白,会发生迟发性的肥胖症和T2DM。10周龄以上的KK-Ay鼠常出现胰岛素抵抗,即胰岛素不敏感,导致胰岛素介导的糖耐量明显下降。这类鼠具有肥胖及代谢紊乱的典型特征,如高血糖、糖耐量降低、胰岛素抵抗、高甘油三酯血症、高血压、瘦素抵抗,这与人类T2DM相似。因此,KK-Ay鼠是研究T2DM高胰岛素和高瘦素机理的理想模型。
根据参考文献及我们的预实验确定,PNS给药12d即出现有统计学意义的降糖效果,所以Rb1、Rg1、Rd、Re、R1组连续给药12d,即可达到观察哪一成分是PNS中主要降血糖成分。而PNS给药30d是为观察它的持续降血糖效应,所以我们选择PNS给药30d。
PNS治疗30d后,KK-Ay鼠的血清胰岛素水平和胰岛素抵抗指数均下降,并伴随FBG和糖耐量的改善,表明了血糖的降低是由胰岛素的敏感性增加引起,提示PNS可能是通过提高胰岛素的敏感性来降低KK-Ay鼠的血糖。胰岛素抵抗会影响胰岛素在各重要靶器官中对糖的利用,因而引起高糖血症和高脂酸血症,而高糖血症和高脂酸血症又会刺激胰岛素的分泌并加重胰岛素抵抗。长期的高血糖可导致机体三大物质代谢紊乱,并发代谢综合征,还能引起β-细胞对葡萄糖浓度变化的敏感性及对高血糖的反应性下降,这种状态被称作葡萄糖毒性作用。本实验表明PNS能够有效的提高KK-Ay鼠对胰岛素的敏感性并促进葡萄糖利用:PNS给药12dFBG下降,给药30d血清胰岛素水平和IRI也出现下降,PNS能够使FBG维持在较低水平,对KK-Ay鼠血糖长期地调节,从而抑制高血糖正反馈调节并改善胰岛素分泌失调。据报道,脂联素是一种重要的内源性胰岛素超敏化激素,能改善胰岛素抗性和降低血糖及甘油三酯水平,本研究中PNS有胰岛素增敏和降糖、降甘油三酯作用,PNS是否通过提高脂联素含量从而增加胰岛素敏感性,有待我们进一步的研究探讨。
本实验的另一结果提示PNS通过提高KK-Ay鼠对瘦素的敏感性,起到抗肥胖症的作用。已有研究表明瘦素在体质量的负反馈调节圈中作为导入信号,使机体热量摄取下降并提高能量消耗。实验中,与模型组相比,PNS组瘦素水平的下降未引起摄食量、脂肪质量和体质量的增加,而是使这些指标降低,表明瘦素调节食欲和能量消耗的敏感性提高了。肥胖伴随高水平的瘦素是导致瘦素抵抗的主要原因,瘦素抵抗又会加重肥胖,进而形成代谢紊乱的恶性循 环,调 节 瘦 素 水 平 和 瘦 素 敏 感 性 对 治 疗T2DM这类代谢综合征极其重要。因此,PNS这类既能降低瘦素水平又能改善瘦素抵抗的药物应得到更多的关注。肥胖是引发T2DM的主要原因之一,已有研究表明肥胖能够增加细胞内质网压力,而细胞内质网压力的增加又会引起c-Jun氮末端激酶〔c-Jun N-terminal kinase(JNK)〕的超活化以及由之 引 发 的 胰 岛 素 受 体 底 物-1〔insulin receptorsubstrate-1(IRS-1)〕的丝氨酸磷酸化,从而导致胰岛素受体信号传导阻断。本研究发现,PNS治疗30d后,血清甘油三酯水平及附睾脂肪垫质量降低,表明PNS能够改善T2DM患者代谢平衡,血清甘油三酯水平降低及脂肪的减少也是机体能量消耗增强的标志。由于大多数T2DM患者存在高脂血症和代谢紊乱,PNS在这方面的治疗效果有重要的临床意义。总之PNS通过控制肥胖症进而提高胰岛素的活性,预防T2DM的形成,具有重要的临床应用前景。
本实 验 根 据PNS中 各 皂 苷 含 量,拆 分 进 行PNS中各皂苷的降血糖作用研究,以寻找对PNS降血糖功效起主要作用的成份,发现Rb1可能为PNS发挥降血糖作用的主要成分。单独使用五种皂苷中的任一成分均无抗肥胖作用,该作用可能是由合用五种皂苷或PNS中的其他成分产生。给药12d后Rb1组FBG下降,其体内降血糖作用与Park等的体外研究相一致。根据Shang等的研究,Rb1在体内可能是通过PPARγ发挥药理作用。高钧等的研究得出Re对SD大鼠有降血糖作用,而本实验中Re降血糖作用不明显,这可能与实验采用不同的动物模型及剂量较小等有关。Rd、Rg1、R1给药12d后无明显的降血糖作用,由于各成分的给药剂量均比PNS的给药剂量(200mg/kg体质量)小,因此并不能过早的断定Rd、Rg1、R1无抗糖尿病作用。我们将进一步实验考察Re、Rd、Rg1、R1在更高剂量下的抗糖尿病作用。
综上,PNS对KK-Ay鼠有抗高血糖和抗肥胖的治疗作用,作用机理是提高胰岛素敏感性并降低瘦素抵抗。T2DM伴有肥胖的患者较非肥胖的糖尿病患者瘦素及胰岛素抵抗更为严重,因此同时具有抗高血糖和抗肥胖症作用的药物对其治疗效果更好。