PCR技木在动物医字方面的研究进展

　　聚合酶链式反应fPolymeraseChainReaction，PCR)是1985年Mullis等人发明的一种特异性DNA体外扩增技术 ，以少量的DNA分子为模板，经过变性一退火一延伸的多次循环，以接近指数扩增的形式产生大量的目标DNA分子。短短几十年，该技术已经成为最常用，也最重要的分子生物学技术之一。其应用范围从基本的基因扩增，扩展到基因克隆、基因改造、传染病源分析、遗传指纹鉴定等，甚至扩展到许多非生物领域伫。本文简述近几年PCR技术在动物医学方面的应用进展，使PCR反应的高特异性、高灵敏度、快速、准确、重复性好等优点更广范地应用于动物医学的研究领域。

1PCR技术的基本原理

用PCR技术进行的基因扩增过程，类似于体内DNA的复制过程，是一种非常简单扩增核苷酸的方法。PCR扩增包括：合成与模板DNA片段单链3端20～30个核苷酸序列互补的一对寡聚核苷酸引物(P，、P：)；高温下使模板双链DNA变性成两条单链；退火时引物分别与两条单链3端的互补序列结合，配对的引物以3端相应；在DNA多聚酶催化下，引物链延伸，使两个引物之间的一段DNA得到复制。经历这样一个过程就是一个反应周期。经过一个反应周期后，被扩增的DNA片段得到加倍。由于新合成的DNA链仍能与引物结合，因此，每条DNA链都可以作为下一轮扩增的模板。这样经过变性、退火、引物与模板结合、链的延伸等周期性过程，使DNA总量呈几何级数增加。经过扩增2O个周期，DNA的量将增加2×10倍。

最初Cetus公司发明的PCR技术所用的酶为E．coDNA多聚酶I的Klenow片段f或称Klenow酶)，其反应温度为37℃，由于这种酶不耐高温，而变性必须在95℃的高温中进行，这种变性温度使多聚酶失活，因此，在每一轮DNA复制过程中，必须加入新的多聚酶，这样不仅操作麻烦，而且容易造成差错。1988年R．KSaiki等人采用从嗜热细菌(Thermusaquaticuis)中分离的耐高温TaqDNA多聚酶用于PCR技术，该酶一是95℃时不变性，二是在65℃下可催化聚合反应，它的使用使PCR技术的发展产生了一次飞跃。近几年，PCR技术又在引物设计、使用标记等方面取得了一系列引人注目的新进展。

2PCR技术在动物医学中的应用

2．1临床检测

以前对病毒感染的临床检测多采用病毒培养，电镜观察及血清学方法等，不仅诊断时间长，且灵敏度低。黄广明等采集人工感染IBDV的鸡只不同间隔时间法氏囊、胸腺、脾、盲肠扁桃体、肾、肝和腿肌进行了原位PCR检测，同时观察各组织病理变化，对鸡传染性法氏囊病毒早期感染过程研究。黄庚明等用广东禽流感无致病力分离株核蛋白基因片段(NPC)的地高辛标记的cDNA探针，并优化了检测禽流感病毒核酸的探针杂交法，能辨别出非免疫鸡胚和SPF鸡胚尿囊液中的禽流感病毒。PCR技术可使单个未形成病毒颗粒的DNA分子迅速扩增至可用于诊断的量，从而可以大大提高灵敏度并使诊断时间缩短至几小时内。

PCR技术在其他微生物和寄生虫的检测应用中也有了很大进展，譬如李树清等利用套式PCR对猪传染性胸膜肺炎进行检测，检测的灵敏度可达113CPU。李辉等首次建立夹心免疫一PCR检测旋毛虫抗原的方法，检测旋毛虫抗原的灵敏度高于传统ELISA方法10倍。吴建中等建立检测产单核细胞李斯特菌的荧光定量PCR方法，并利用此方法检测人工污染的牛奶中产单核细胞李斯特菌的含量。

2．2免疫预防

目前，我国控制疫病的最有效措施仍然是接种疫苗。随着常规疫苗的广泛使用，另一种新的问题也随之产生，而且已成为今后防制工作必须要解决的问题，这就是疫苗免疫动物与自然感染动物的鉴别诊断问题。因此，研究者们利用PCR等生物技术克隆出编码保护性抗原基因制备成疫苗已经成为一种新的发展趋势。

自1981年成功地将口蹄疫病毒的抗原性多肽基因VP3克隆到大肠杆菌内并制成用于牛和猪的疫苗后，基因工程疫苗又成功地应用于猫白血病疫苗以及预防仔猪腹泻病的K。。疫苗等的研究。寄生虫抗原十分复杂，常规疫苗的研制十分困难，使得基因工程疫苗的研制成为必然趋势，虽然起步较晚但也取得了一定进展。Pogonka等用重组SO7一沙门氏菌口腔免疫3周龄白来航鸡，2周后测到了抗SO7的特异性抗体，抗体水平维持6周。用小鼠动物模型进行猪囊尾蚴病的免疫试验，2组免疫小鼠的减虫率分别为96．9％和98．4％，该疫苗可同时激发动物的体液免疫和细胞免疫反应，增强机体的免疫调节功能及杀伤性T淋巴细胞功能，有望达到商品化生产。

3展望

随着动物医学的不断发展，PCR技术凭着具有简单、快速、灵敏、特异性强等优点引起畜牧兽医科研工作者的广泛关注，并迅速在多个领域中得到推广和应用。随着PCR技术的不断发展和完善，尤其是其自动化的实现，应用前景必将更加广阔。