引言
我国是世界上最大的小麦生产国，为确保粮食的安全储藏，每年都要使用杀虫剂进行一次或多次熏蒸。只有准确地检测出仓储活虫种类和数量，才能做到有目的的防治。
粮虫死亡后，人眼通过其体表颜色无法准确地和活虫进行区分。目前，人工判断粮虫是否死亡的方法非常耗时，且效率很低; 基于计算机视觉的粮虫识别方法也不能自动判别出仓储害虫的“死”“活”。生命体征标志着生物体生命活动的状态，因此要准确地区分活虫和死虫，需要提取出能有效表征活虫和死虫的重要生命体征。粮仓中常见的粮虫体长在 5mm 以内，体型很小，属于变温动物，因而无法提取其体温、呼吸、血压、心跳等基本的生命体征。
高光谱成像技术具有“图谱合一”的特性，该技术已应 用 于 发 芽 麦 粒、粮 虫 感 染 谷 物 质 量 的 评 估等。本项研究的目标是探索利用近红外高光谱成像技术检测仓储粮虫生命体征的可行性。
1 材料和方法 1． 1 样本准备
小麦( 购买于镇江市面粉厂) 经水漂洗烘干处理后，和谷蠹活虫一起放入养虫器皿，并置于 28℃，80%RH 的恒温恒湿培养箱中饲养，5 天后筛出成虫，谷蠹虫卵 8 周后即变为成虫。
从养虫器皿中筛出 3g 谷蠹成虫，置于液氮中10min，取出后平衡 15min，并放置在 20 ～ 22℃ ，55%～ 60% RH 的高光谱采集室中，供后续的分析处理。
本文采用刚杀死的谷蠹成虫作为活虫样本进行分析，这是由于其细胞活性还没有发生变化。
1． 2 近红外高光谱图像获取
利用课题组构建的近红外高光谱成像系统，对粮虫进行高光谱图像的采集。该成像系统采集到的光谱范围是 871． 6 ～ 1 766． 3nm。经多次实验表明，获取清晰粮虫图像的采样条件如下: 近红外相机的曝光时间为 3ms，位移台的移动速度为 0． 59mm/s。
随机挑选 28 头谷蠹死虫，平均分为 4 组，大致呈直线于白色塑料板上。分别于第 0，0． 5，1，1． 5，2，2． 5，3，4，5，6，7 天，对每组谷蠹样本进行高光谱图像采集。
1． 3 高光谱图像分析
针对 1 450nm 波长的粮虫图像，手工选取每个粮虫的多边形感兴趣区。每个粮虫感兴趣区内所有像素的光谱平均值为该粮虫的光谱，每个采样时间内采集到的所有粮虫光谱的平均值为该采样时间的粮虫光谱。通过分析粮虫光谱随时间( 死亡天数) 的变化趋势，可确定活虫和死虫区分度较大的光谱区间，并可初步确定活虫和死虫可区分的最短时间。根据初步确定的可区分最短时间，求取该采样时间的粮虫光谱与第 0 天的粮虫光谱的差分，其最大差值所对应的波长为提取的最优光谱波长。
本文采用区域生长法对最优波长下的粮虫灰度图像进行自动分割，用区域标记法形成标记矩阵。当分割出的二值图像中某个目标的面积( 像素数) 大于 30 时，该目标即被归类为粮虫活虫，否则应归类为杂质。
1． 4 粮虫体内组分的测量
在上述每一个光谱采样时间，称取 3 份 25mg 左右的死虫样本，作为每份谷蠹样本的总质量 wt; 然后，对死虫样本采用《食品中水分的测定》中的直接干燥法进行烘干处理。烘干后取出称重并记录，作为每份谷蠹的干质量 wd。每份谷蠹样本的含水率为 rw=( wt－ wd) /wt，最后以 3 组样本含水率的平均值作为该时间点谷蠹的含水率。由于单头谷蠹活虫的质量在 1． 07mg 左右，其干重则更小，若测量单头的含水率，其误差非常大。因此，本文以多头粮虫的平均含水率作为单头粮虫的含水率进行分析。谷蠹液氮低温猝死后，每类粮虫称取 75mg 左右，并记录质量作为该粮虫的鲜质量，用于第 1 个时间点 ATP 合成酶活性的测定。按照同样的方法再称取 9 份粮虫，每份质量依次增加 10mg 左右，用于此后每个时间点 ATP 合成酶活性的测定。在每个时间点取出该份粮虫，并测定其 ATP 合成酶活性。每个时间点测定 3 次，取 3 次测定活性的平均值作为该时间点粮虫的 ATP 合成酶活性。按照同样的方法可对粮虫蛋白质含量进行测定。ATP 合成酶的活性采用比色法进行定量检测，蛋白质含量的测定方法为 BCA( Bicinchoninic Acid) 蛋白含量测定法。
2 结果与讨论
2． 1 粮虫光谱的变化趋势
粮虫在某天的光谱为该天采集到的 4 组粮虫样本光谱的平均，谷蠹死后 0 － 7 天的光谱变化趋势如图 1 所示。由图 1 可见，死后谷蠹的平均相对光谱的反射率随着谷蠹死亡时间的增长而增加。反射光谱在 1 400 ～1 500nm 范围内有明显的吸收峰，使活虫和死虫都有一个很低的反射率。在 1 320 ～ 1 700nm 之间光谱的有较好的区分度，在其他区间的光谱没有区分度或者区分度比较小。第 1 － 3 天粮虫光谱的变化较大，自第 3 天开始其光谱不再发生明显的变化。
根据以前的研究成果，谷蠹死后第 0 天和第 3 天粮虫的标准差光谱在 1 330nm 和 1 720nm 处有交叉。为了进一步提高区分度，可将有效光谱的范围取为1 370 ～ 1 700nm 之间的 100 个波长。 2． 2 特征波长 在粮虫的最佳特征波长下，死虫和活虫的图像灰度值应具有最大的离差。因此，粮虫的最佳波长可取为死虫和活虫光谱差分的最大值所对应的波长。粮虫谷蠹死后第 0 天和第 3 天在 1 370 ～ 1 700nm 之间的光谱曲线及其差分曲线如图 2 所示。由图 2 可知:差分曲线的最大值为 0． 442 7，其对应的特征波长为1 417． 2nm，则该波长即为所求的特征波长。 2． 3 图像分析结果
针对谷蠹死亡之后第0 天和第4 天的图像进行区域生长法处理后发现: 选择图像中所有灰度值小于等于 40 的点作为“种子”，可使活虫目标区域的部分像素被选中作为“种子”，而死虫目标区域中的所有像素都不被选中，且全局阈值取为 80 时可使分割后的目标比较完整。谷蠹死后 1． 0 天时的区域生长法分割图如图3 所示。采用区域生长法对图3( a) 中1 417．2nm的灰度图像处理后的结果如图 3( b) 所示。由图 3 可知: 死后第 1 天时，图 3( a) 中的 7 头谷蠹中分割出了4 个目标，其余 3 头谷蠹死虫由于其所有像素的灰度值都高于 40 而没有“种子”点，因此被分割为背景。
由标记矩阵计算的 4 个目标的面积自左到右依次为564，649，581 和 683。由判别阈值 30 可知，这 4 个目标应该全部被判别为活虫。因此，图 3 中仅有 3 头死虫被正确检测出来，其余 4 头判别错误。这表明，在谷蠹死后 1 天时，该法不能把活虫和死虫完全正确地区分出来。用该法对 11 个采样时间所采集的所有粮虫图像进行了处理，结果表明: 第 0 天的谷蠹活虫都被正确识别，第 0． 5，1，1． 5，2 天的识别率分别是 0，28． 57% ，71． 43% 和 82． 61% ; 自第 2． 5 天开始，谷蠹全部被正确识别，即识别率全部为 100% 。试验结果表明，粮虫死后第 2． 5 天为活虫和死虫完全可分的最短时间。
2． 4 特征光谱与生命体征的关系
以谷蠹体内的组分含量为自变量，以 1 417． 2nm下谷蠹图像的平均灰度值为因变量，二者之间的相关关系如图 4 所示，二者之间的回归分析结果如表 1 所示。由表 1 可知，谷蠹在特征波长下图像平均灰度值和其体内的 ATP 合成酶活性、蛋白质含量之间具有很强的负指数相关关系，与水分含量之间具有很强的负线性相关关系。可见粮虫死后，随着死亡时间的增加，其体内的 ATP 合成酶活性、蛋白质含量、水分含量整体上呈下降的趋势，使粮虫在 1 417． 2nm 波长下的光谱反射率增加，因而粮虫在 1 417． 2nm 波长下图像平均灰度值增加。这是由于粮虫死亡后，线粒体呼吸链电子传递功能、氧化磷酸化的偶联作用受损，使ATP 合成酶含量及其活性的降低，ATP 合成酶是位于细胞线粒体中合成能量分子 ATP 的关键性的酶，ADP在转变为 ATP 时需要消耗大量的自由能，因此活虫的大分子物质分解所释放的能量被储蓄在 ATP 中，而死虫的大分子物质( 如蛋白质、核酸、糖类等) 分解释放的能量不能被储蓄在 ATP 中，而被耗散掉，从而直接导致了蛋白质、核酸等大分子物质的分解，因此活虫和死虫的代谢差异在于死虫的异化作用旺盛于活虫，这种异化作用表现在生物大分子物质分解和释放能量的过程，则粮虫死亡之后，其体内的化学组分必然发生变化。近红外光谱表征含氢基团( C － H、N － H、O － H等) 振动的倍频和合频吸收。当粮虫死亡后，其体内ATP 合成酶的活性下降，促使蛋白质、核酸等大分子物质分解为 H2O 和 CO2等并且被耗散掉，从而导致含氢基团振动的倍频和合频吸收带内粮虫近红外光谱反射强度的增加。粮虫的特征光谱( 1 417． 2nm) 位于O － H 键 1 级倍频及 C － H 键 1 级倍频的合频吸收带内，粮虫死亡之后，其近红外特征波长中粮虫图像的整体灰度值增大。
谷蠹在1 417． 2nm 波长下图像平均灰度值和其体内的 ATP 合成酶活性、蛋白质含量、水分含量之间的相关系数全部小于 － 0． 9，其中与水分含量的线性相关系数均小于 －0． 98。由此可见，粮虫特征波长图像中的整体灰度值可以表征其生命体征( 体内化学组分) 的变化，使特征波长图像中活虫和死虫的自动区分成为可能。
3 结论
谷蠹死亡后，其相对光谱反射率逐渐提高，到死后第 3 天时光谱曲线趋于稳定。应用最大离差法提取出可区分活虫和死虫的最优波长为 1 417． 2nm。从粮虫死亡后的第 2． 5 天开始，粮虫活虫与死虫完全可分。粮虫在1 417． 2nm 下图像平均灰度值和其体内的ATP 合成酶活性、蛋白质含量之间具有很强的负指数相关关系，与水分含量之间具有很强的负线性相关关系。研究结果表明，利用近红外高光谱成像技术对粮虫的生命体征进行鉴别是可行的。
参考文献:
［1］ 胡玉霞，张红涛，毛罕平，等． 基于多分辨率分析的储粮害虫图像预处理研究［J］． 农机化研究，2012，34( 8) : 160 －163． ［2］ Neethirajan S，Karunakaran C，Jayas D S，et al． Detectiontechniques for stored － product insects in grain［J］． FoodControl，2007，18( 2) : 157 － 162． ［3］ 毛罕平，张红涛． 储粮害虫图像识别的研究进展及展望［J］． 农业机械学报，2008，39( 4) : 175 －179．