南美白对虾干虾壳甲壳素提取工艺比较及蛋白质回收
作者：不详 更新时间：2015-9-20 9:23:22
摘要：以南美白对虾（Penaeus vannamei）干虾壳为原料，采用5种方法提取甲壳素，同时对蛋白质进行回收，得出从干虾壳中提取制备食品级甲壳素最优方案。结果表明，方法Ⅴ为最优方案，即虾壳预处理为5 mm大小，10%柠檬酸浸泡13 h， 10% NaOH于97 ℃处理3 h，再经过10% H2O2 80 ℃水浴浸泡2 h氧化脱色，处理过程中料液比（m∶V，g∶mL）均为1∶10，可制得残留氮量2.20%、灰分含量1.33%、产率为25.16%的食品级甲壳素。产生的废液采用乙醇沉淀法回收蛋白质可减少污染，节约成本。
关键词：南美白对虾（Penaeus vannamei）；干虾壳；甲壳素；蛋白质；回收
Abstract： Taking Penaeus vannamei as raw material， five chitin extracting methods，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，were researched to determine the optimal scheme of food-grade chitin extraction and preparation. The results showed that the method Ⅴ was the best extraction process. Namely that 5 mm of dried shrimp shell should be soaked for 13 h in 10% citric acid，treated for 3 h with 10% NaOH at 97 ℃， and then take a 80 ℃ water bath in 10% H2O2 for 2 h for oxidative decoloration，with solid-liquid ratio always 1∶10.Under this condition，the yield of food-grade chitin， containing residual nitrogen 2.20% and ash content 1.33%，was 25.16%. Moreover，proteins were recycled from the waste liquid by ethanol precipitation techniques to reduce pollution and save cost.
Key words： Penaeus vannamei； dried shrimp shell； chitin； protein； recycling＼
甲壳素是一种天然高分子聚合物，是自然界除蛋白质之外数量最多的含氮有机高分子，广泛存在于甲壳纲动物虾、蟹等的外壳和骨骼中，常与钙、蛋白质等结合在一起构成生物体的支撑组织[1]。地球上每年生物合成量约有100亿t，产量仅次于纤维素，是地球上的第二大可再生资源，参与生态系统中的碳、氮循环，对地球的环境和生态保护起着十分重要的调控作用。因此，甲壳素资源的开发与应用研究受到了国内外学者的广泛重视，其范围涉及到农业、工业、医药卫生、日用化工、食品保健、印染、环保、酶的固定化载体、金属的提取与回收以及功能膜材料等诸多领域[2，3]。
较常见的甲壳素制取方法有HacKman法和Shimahara法[4]，这些方法是利用稀碱除去蛋白质，再用稀酸除去碳酸钙，得到较纯的甲壳素。一般来说，优质的甲壳素常常以灰分含量及残留氮量作为参考依据，以上含量以低者为佳，高者为劣。其制取法最为常见的有化学法、生化发酵法和微生物法，而其中最具商业经济开发应用规模的是化学法。因此本试验选取南美白对虾（Penaeus vannamei）干虾壳制备甲壳素，对5种甲壳素制备工艺流程进行比较优化，为有效利用生物资源提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
材料及试剂：南美白对虾干虾壳，福建省诏安县海利水产食品有限公司提供；所用试剂均为分析纯。
仪器设备：循环式真空泵（SHZ-DⅢ型），予华仪器有限责任公司；高速万能粉碎机（FW.80型）， 天津泰斯特仪器有限公司；马弗炉（SX-4-10），建力电炉制造有限公司；凯式定氮仪（K9840）， 奥卓生物科技有限公司；数显鼓风干燥箱（GZX-9240MBE），上海博讯实业有限公司医疗设备厂；高速冷冻离心机（GL-24M），长沙湘麓离心机仪器有限公司。
1.2 甲壳素制备方法
以下5种甲壳素制备方法中，料液比均为质量体积比（m∶V，g∶mL）。
1.2.1 方法Ⅰ制备甲壳素[5] ①脱蛋白。准确称取南美白对虾干虾壳10 g，加入100 mL 2.5 mol/L NaOH 溶液，持续搅拌6 h。停止搅拌，捞出虾壳，再加入100 mL 2.5 mol/L NaOH 溶液浸泡24 h。2次浸泡完成后将虾壳捞出，经纱布过滤后水洗至中性。于103 ℃烘箱烘干称重。②脱盐。将脱蛋白后的虾壳加入100 mL 1 mol/L HCl溶液搅拌反应30 min，捞出虾壳，再用100 mL 1 mol/L HCl溶液搅拌反应30 min，经纱布过滤后用大量水洗至中性，于103 ℃烘箱烘干称重。③脱色。脱蛋白脱盐后的甲壳素为基本呈白色并带红色的片状物，加入无水乙醇（料液比为1∶5），加热回流1 h。过滤后所得沉淀用清水漂洗，再置于0.1% KMnO4溶液（料液比为1∶2）浸泡1 h。然后过滤，用1% NaHSO3溶液（料液比为1∶2）浸泡1 h，水洗后于110 ℃烘箱烘干，得到灰白色的甲壳素成品。 1.2.2 方法Ⅱ制备甲壳素[6] ①脱蛋白。准确称取南美白对虾干虾壳10 g，加入去离子水（料液比为23∶100），放入恒温水浴箱，从40 ℃开始，每30 min升高5 ℃，直至升到65 ℃，历时3 h，然后取出，用去离子水洗净残渣，烘干，用粉碎机打磨成40目的脱蛋白虾粉，称重，放在干燥器中备用。②脱盐。将脱蛋白虾粉加入到100 mL、pH 8、9% EDTA-Na2溶液中，在25 ℃、125 r/min条件下振荡反应2.5 h后，抽滤洗涤至中性，连同滤纸一起于103 ℃烘箱烘干，小心刮下无损失转移至坩埚，计算得率。③脱色。将脱蛋白和脱无机盐的样品用10%的H2O2（料液比为1∶10）于80 ℃水浴浸泡2 h，水洗，于110 ℃烘箱烘干，得到甲壳素成品。
1.2.3 方法Ⅲ制备甲壳素[7] ①脱蛋白。准确称取南美白对虾干虾壳10 g，放入三口烧瓶中，装好并打开冷凝回流装置，加入200 mL 8% NaOH溶液（料液比为1∶20），90 ℃水浴中反应1 h，结束后去离子水洗至中性，干燥后，凯氏定氮法测定氮含量。②脱盐。称取脱蛋白后的样品于烧杯中，加入1.0 mol/L HCl溶液（料液比为1∶10），50 ℃下搅拌1 h，反应结束后抽滤水洗至中性，于103 ℃烘箱中干燥3～4 h后测定灰分含量。③脱色。将脱蛋白和脱无机盐的样品用10% H2O2 （料液比1∶10）于80 ℃水浴浸泡2 h，水洗，于110 ℃烘箱烘干，得到甲壳素成品。
1.2.4 方法Ⅳ制备甲壳素[8] ①脱盐。准确称取10 g南美白对虾干虾壳，破碎成5 mm的小片，室温下在100 mL 3.0% HCl中浸泡l5 h，抽滤洗至中性，于103 ℃烘箱烘干称重，测定灰分含量。②脱蛋白。将脱去矿物质的试样置于100 ℃、8% NaOH溶液（料液比1∶10）浸泡4 h，抽滤水洗至中性，于103 ℃烘箱烘干称重，测定氮含量。③脱色。将脱蛋白和无机盐后的样品用10% H2O2（料液比1∶10）于80 ℃水浴浸泡2 h，水洗，于110 ℃烘箱烘干，得到甲壳素成品。
1.2.5 方法Ⅴ制备甲壳素[9] ①脱盐。准确称取南美白对虾干虾壳10 g，将其剪碎为5 mm粒度大小，用10%柠檬酸钠（料液比为1∶10）处理13 h。水洗至中性于103 ℃烘箱烘干，测定灰分含量。②脱蛋白。取已经脱无机盐的虾壳，加入10% NaOH（料液比为1∶10），97 ℃下保温3 h，去离子水洗至中性，于103 ℃烘箱烘干称重，测定氮含量。③脱色。将脱蛋白和脱无机盐的样品用10% H2O2（料液比1∶10）于80 ℃水浴浸泡2 h，水洗，于110 ℃烘箱烘干，得到甲壳素成品。
1.3 样品中化学成分的测定
水分含量测定：称取以上方法所得样品，采用直接干燥法[10]进行测定；灰分含量测定：称取以上方法所得样品，先在电热板上以小火加热使试样充分炭化至无烟，然后置于马弗炉中于（550±25） ℃至灰化完全[11]，测定灰分含量；残留氮量采用微量凯式定氮法[12]进行测定。
1.4 蛋白质的回收及回收方法的比较
通过等电点沉淀法[13]、盐析沉淀法[14]和有机溶剂沉淀法对碱水解后的废液进行蛋白质回收，比较蛋白质回收率，得出最佳回收方案。
2 结果与分析
2.1 5种甲壳素制备方法的比较结果
由表1可知，方法Ⅰ制备的甲壳素的平均残留氮量为2.67%，小于3%，灰分平均含量为1.26%，小于1.5%，均低于甲壳素食品级国家标准[15]，且产率也较高。不足之处是提取过程中脱蛋白质、脱盐时间长，次数多，在脱色工艺步骤中，用到的试剂有无水乙醇、高锰酸钾、亚硫酸氢钠等，操作复杂，成本高，成品的色泽是灰白色，效果并不十分理想。
方法Ⅱ制备的甲壳素的残留氮量和灰分含量未达食品级甲壳素要求[15]，但是可用于日化、纺织、农业等方面。其脱蛋白利用水浴梯度升温达到自溶的目的，而脱盐虽是用的较为昂贵的EDTA-Na2，但可经回收得到EDTA沉淀，经测定回收率为100%。此方法的优点在于有效解决了传统方法污染环境、耗能大、生产成本高的问题，操作步骤简单，生产周期短，且在制备甲壳素的同时回收了蛋白质水解液和EDTA，但甲壳素未达到食品级标准，再考虑生产成本，所以方法Ⅱ不能考虑为最优方案。
从食品级甲壳素的标准来看，方法Ⅲ的残留氮量超出食品级国家标准，灰分平均含量为1.29%，小于1.5%，符合食品级国家标准，且产品得率比方法Ⅱ中要高。但就其生产成本来看，脱蛋白环节对碱的需求量比方法Ⅱ、方法Ⅳ、方法Ⅴ中多出1倍，且需要冷凝回流装置，对设备要求比之其他方法要高。
方法Ⅳ制备所得的甲壳素平均残留氮量为2.42%，灰分平均含量为1.49%，都达到了食品级甲壳素的要求。产品平均得率为19.66%，高于方法Ⅱ的16.99%、方法Ⅲ的18.53%，而略低于方法Ⅰ的21.09%。但是从生产成本来看，方法Ⅳ优于方法Ⅰ。方法Ⅳ中所用酸碱等化学试剂量要少，脱色环节简单，成品色泽为白色，且生产周期短。由此看来，方法Ⅳ具有一定优势。
方法Ⅴ制备所得的甲壳素无论是残留氮量还是灰分含量，都符合食品级甲壳素国家标准，且产率也是5种方法中最高的。从生产设备要求上来看，与方法Ⅳ相差不大，而更优于方法Ⅳ的是：在对废液的处理中，方法Ⅴ中同样是用盐酸中和蛋白质废液回收得到蛋白粉，但方法Ⅴ不仅能回收蛋白粉，还可以用柠檬酸废液结合脱去的钙离子，得到副产物柠檬酸钙。
2.2 等电点沉淀法回收蛋白质的结果
由图1可知，若采用等电点沉淀法回收蛋白质，则pH 5.0时最接近该蛋白质的等电点，此时溶液最浑浊，析出的蛋白质最多，蛋白质的回收率为73.0%。在盐析法和有机溶剂沉淀法回收蛋白质试验中，蛋白质为亲水性生物大分子，在水溶液中具有双电子层和水化膜以保证分子的稳定性。当加入中性盐（NH4）2SO4时，（NH4）2SO4会电离成离子态，破坏了蛋白质的双电子层，从而使其沉降、析出，通过盐析法测得蛋白质的回收率为84.8%。而有机溶剂沉淀法中，乙醇能改变蛋白质表面电荷，破坏水化膜，导致蛋白变性而沉淀出来，此方法所得蛋白质的回收率为76.4%。
3 结论
3.1 5种甲壳素制备方法的比较
通过对比分析发现，从残留氮量和灰分含量是否符合食品安全国家标准[15]以及产品得率等方面来看，在这5种方法中，方法Ⅴ是最优方案，即虾壳粒度大小5 mm， 10%柠檬酸处理13 h脱钙；10% NaOH 97 ℃保温3 h脱蛋白；10%的H2O2 80 ℃水浴浸泡2 h脱色，处理过程中料液比（m∶V，g∶mL）均为1∶10，在此工艺条件下得出的甲壳素残留氮量为2.20%，低于3.0%，灰分含量为1.33%，低于1.5%，并且产品得率25.16%是5种方案中最高的。虽然在灰分含量的测出结果上比之方法Ⅰ、方法Ⅲ的含量相对要高，但也符合食品安全国家标准。
3.2 蛋白质回收方法的比较
通过比较有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法和盐析法回收蛋白质，结果表明，蛋白质的回收率分别为76.4%、73.0%和84.8%，盐析法回收蛋白质得率最高。但（NH4）2SO4沉淀蛋白质时，（NH4）2SO4会少量存在于样品中，用其加工成食品或饲料添加剂会残留少量氨的气味，影响食品或饲料的味道和口感。而乙醇沉淀蛋白质时，其回收率为76.4%，较盐析法略低，但回收的蛋白质可通过加热去除残留的乙醇，同时离心后的上清液可通过蒸馏的方式对乙醇回收，节约生产成本。因此，综合以上因素，乙醇沉淀法回收蛋白质为最佳方案。
目前从南美白对虾干虾壳中提取甲壳素的各工艺中，化学法因具有工艺条件简单，设备要求不高、提取成本低廉等优点仍占主导地位。虽然曾有学者[16，17]认为化学法可能对环境污染较大，主张研究以生物法来提取，但是生物提取设备要求高，成本高，且不易控制生产条件。而本试验采用方法Ⅴ制备甲壳素，同时将脱蛋白后的废液用乙醇沉淀法回收蛋白质，烘干后得到的蛋白质粉末可继续加工，制成蛋白质水解液，用于食品添加剂或饲料中，变废为宝，大大降低了对环境的污染，同时有效提高了原材料的附加值。
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